木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究
2016-05-09陈志勇曲彩红高程海
陈志勇，曲彩红，卢 静，程 刚，高程海
（1.空军大连通信士官学校，辽宁大连116600；2.广西科学院广西近海海洋科学重点实验室，南宁530007）
( 1.成都军区昆明总医院天然药物研究中心，昆明650032；2.云南中医学院，昆明650500 )
木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究
陈志勇1，曲彩红1，卢 静1，程 刚1，高程海2*
（1.空军大连通信士官学校，辽宁大连116600；2.广西科学院广西近海海洋科学重点实验室，南宁530007）
木榄为红树科木榄属植物，其在广西沿海地区有用作食物的传统，同时有消炎、治疟疾和清热解毒等功效。该研究以采自广西北仑河口国家级自然保护区的红树木榄（Bruguiera gymnorrhiza）胚轴为对象，应用现代色谱方法（硅胶柱色谱、制备液相及制备薄层色谱等），从中分离获得1个生物碱类单体化合物。运用光谱分析技术(HRMS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC)鉴定其化学结构，发现为新化合物，命名为Gymnorrhizin A。运用MTT法，发现该化合物在对乙肝病毒表面抗原（HbsAg）和乙型肝炎e抗原（HbeAg）的50%抑制浓度（IC50）分别为4.37 mmol·L-1和4.89 mmol·L-1，治疗指数（TI）分别为2.68和2.40。通过对红树木榄胚轴化学成分进行深入研究，阐明其中抗乙肝病毒活性物质基础，为相关新药研发提供了科学依据。
天然产物研究，生物碱，乙肝病毒表面抗原，乙型肝炎e抗原，治疗指数
木榄（Bruguiera gymnorrhiza）为红树科木榄属植物，主要分布于非洲、东南亚、美洲加勒比海的海岸线沿岸，在中国主要分布于广东、广西、海南、福建和台湾等地（高程海等，2011）。广西沿海城市防城港、北海和钦州都分布有木榄，其在广西沿海地区有用作食物的传统，同时也有消炎、治疟疾和清热解毒的功效（邵长伦等，2009）。虽然对红树木榄根茎叶的化学成分已有研究，但文献调查发现仅有对木榄属植物B. parviflora的胚轴粗提物进行抗氧化活性评价（Bunyapraphatsara et al，2003）。
笔者之前报道了木榄胚轴含有苯丙素类化合物、醇苷类化合物（易湘茜等，2013，2015）。本文承接以上研究，继续深入研究红树木榄中次生代谢产物，从中获得1个新生物碱类化合物，并测试了其抗乙肝病毒活性，为相关新药研发提供科学依据。
1材料与方法
1.1 仪器与材料
Brucker Avance 600型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司），Waters e2695 Alliance分析半制备高效液相色谱仪，N-1100V-W旋转蒸发仪（日本东京理化株式会社），LCQDECAXP ESI质谱仪（美国Finnigan公司），SIM-F140AY65型制冰机（日本Sanyo公司），CO2恒温细胞培养箱（HERA，German），Olympus倒置相差显微镜（Japan CK-40-P200），MS3型振荡器（德国IKA公司），IKA MS3 basic圆周振荡器（广州艾卡仪器设备有限公司）。
柱层析正相硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂），高效薄层色谱预制板（烟台化学工业研究所），HepG2.2.15细胞株（上海研域生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），1640培养液（gibco，USA），胰蛋白酶（北京索莱宝生物），拉米夫定（葛兰素史克制药有限公司）。
2011年6 月在广西北仑河口红树林自然保护区采集研究样品，经王新助理研究员（广西红树林研究中心）鉴别为红树科（Rhizophoraceae）木榄属（Bruguiera）木榄（B. gymnorrhiza）的胚轴。木榄胚轴标本保藏于广西科学院广西北部湾海洋研究中心（编号：2011-GXAS-018）。
1.2 提取与分离
将新鲜的木榄胚轴（湿重约12.0 kg）粉碎后使用有机溶剂（VCH2Cl2:VC2H5OH=1:2）在室温下浸泡7 d，重复3次，每次获得的浸出液经减压浓缩得总提取物（915 g）。分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂对总提取物萃取，减压回收溶剂，依次得到氯仿萃取物（干重59.0 g）、乙酸乙酯萃取物（干重52.0 g）和正丁醇萃取物（干重171.0 g）和水相剩余物。
取适量硅胶粉至乙酸乙酯萃取物（52.0 g），充分搅拌干燥和研磨后装入正相硅胶柱。依次用氯仿-丙酮洗脱系统（CHCl3:Me2CO=10:0-5:4/V:V）和氯仿-甲醇洗脱系统（CHCl3:MeOH=10:1-0:10/V:V）进行梯度洗脱，流分经薄层层析色谱检测后合并为12个分离部位（Y1-Y12）。组份Y7用半制备型高效液相色谱HPLC分离纯化，在梯度MeOH:H2O=5:95/V:V处，获得化合物1（1.2 mg，t=19.02 min）。
1.3 化合物1的结构鉴定
运用1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、HRMS等分析方法，对分离得到的化合物1进行结构鉴定。
1.4 化合物1抗乙肝病毒活性筛选测试
采用孙静等（2014）的方法，用二甲基亚砜（DMSO）溶解化合物1为母液，临用前用细胞培养液将母液依次稀释成10、5、2.5、1.25、0.625 mmol·L-1等5个浓度梯度。阳性对照为拉米夫定，浓度0.1 mmol·L-1。
肝癌细胞HepG2.2.15复苏后，再传代，以每升1×107个接种于96孔培养板。培养2 d以等待细胞贴壁，然后加入上述所配不同浓度梯度的含药培养液，同时设仅加正常培养液的阴性对照组和含1 mmol·L-1拉米夫定的阳性对照组，每组设3个平行样，继续培养6 d，分离上清液的低温保存待用，剩余部分加5 g·L-1MTT 20 μL，在37℃孵育4 h，震荡10 min，在吸收波长为490 nm处测试其吸光度值，计算得到细胞抑制率和TC50。用ELISA法对低温保存的上清液中HbsAg和HbeAg进行检测，出现显色反应后，用酶标仪读取在A450 nm的吸收值。利用公式计算获得抗原抑制率和半数有效浓度(IC50)。治疗指数(TI)=TC50(半数毒性浓度)/IC50(半数有效浓度)。（其中TI≤1为毒性作用，1 2.1 结构鉴定 化合物1为墨绿色晶体，易溶于甲醇。三氯化铁溶液显色为紫色。比旋光度（[α] 20 D）为–57.2°(c 0.54，MeOH)。IR谱显示有羟基(3 428 cm-1)，酰胺基(1 667 cm-1)和芳香环(1 604 cm-1)等官能团。HR-ESI-MS（m/z: 269.155 8 [M+H]+）提示分子量为268. 156 9，再结合1H NMR和13C NMR谱确定化合物1分子式为C14H23NO4，具有4个不饱和度。结合1H-NMR和13C-NMR谱，提示有3个不饱和度为三个碳碳双键，因此，该化合物存在1个苯环。UV谱在lmax237和348 nm处有最大吸收。1H NMR谱在展示存在3个氧甲基dH3.82 (3H，s，3-OCH3)，3.82 (3H，s，5-OCH3)，3.73 (3H，s，4-OCH3)和2个氮甲基3.35（3H，s，NCH3），3.35（3H，s，NCH3），2个亚甲基2.78 (1H，dd，5.4，13.8，Hb-1ʹ)，2.62(1H，dd，7.8，13.8，Hb-1ʹ)，3.50 (2H，m，H-3ʹ)，3个次甲基6.56 (1H，s，H-2)，6.56 (1H，s，H-6)，3.80(1H，m，H-2ʹ)。13C NMR和DEPT谱表明了五个甲基dC49.9（N-CH3），49.9（N-CH3），56.5 (OCH3)，56.5 (OCH3)，61.1 (OCH3)，二个亚甲基(dC41.2，66.6)，三个次甲基(dC74.4，107.7，107.7)和四个季碳的存在(dC136.4，137.4，154.2，154.2)。 以上这些数据类似于化合物elemicin（Jayasinghe et al，2003）和3，4，5-trimethoxy-α- aminomethylbenzyl alcohol (Heacock & Hutzinger，1962)，以上信息提示该分子具有四取代的芳香环母核。 在HMBC谱中，从dH3.82 (3H，s，OCH3)到dC154.2 (C-3)，dH3.73 (3H，s，OCH3)到dC137.4 (C-4)，dH3.82 (3H，s，OCH3)到dC154.2 (C-5)之间的相关性表明了3个甲氧基分别与苯环上的C-3、C-4和C-5相连。从dH3.35 (2×NCH3)与dC66.6 (C-3ʹ)相关表明，氮甲基结构单元与C-3ʹ相连。从1H-1H COSY可知，存在H-2ʹ和Ha-1ʹ/Hb-1ʹ/H2-3ʹ相关，表明存在-CH2-CH(OH)-CH2-结构片段。从Ha-1ʹ(2.78，dd，5.4，13.8)和Hb-1ʹ(2.62，dd，7.8，13.8)与dC136.4 (C-1)相关表明，揭示结构片段-CH2-CH(OH)-CH2-位于苯环骨架的C-1位置上。另外，2×NCH3和dC66.6（C-3ʹ）确定2×NCH3接连在C-3ʹ。基于以上数据，最终确定了化合物1的结构（图1）。化合物1的1H和13C NMR谱的数据归属通过HSQC和HMBC谱确定（见表1），命名为Gymnorrhizin A。 图1化合物1的结构Fig. 1 Structure of Compound 1 图2化合物1的关键HMBC和1H-1H COSY相关Fig. 2 Key HMBC correlation and1H-1H COSY of Compound 1 2.2 抗乙肝病毒活性测试 MTT法作为一种检测细胞存活和生长的方法，已经广泛应用于生物因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验及肿瘤放射敏感性测试。本实验应用该方法观察化合物1在具有抗HBV活性 表1 化合物1的1H (600 MHz)和13C (150 MHz) NMR核磁数据（氘代甲醇）Table 11H (600 MHz) and13C (150 MHz) NMR data of Compound 1 (CD3OD，δ in ppm) 的同时对HepG2.2.15细胞本身的生长是否有影响。结果显示，0.625 mmol·L-1时化合物1对细胞的抑制与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。说明此浓度下的化合物1对HepG2.2.15细胞本身的生长没有影响，即对细胞本身没有毒性作用。其他浓度下均对HepG2.2.15细胞正常生长有不同程度的抑制作用，即对细胞本身有毒性作用。但10 mmol·L-1时，化合物1和0.1 mmol·L-1拉米夫定组在细胞毒性上差异无统计学意义(P>0.05)。 表2 化合物1对HepG 2.2.15的细胞毒活性及其分泌HbsAg和HbeAg的抑制作用Table 2 Inhibition rate of Compound 1 on HbsAg and HbeAg secretion of HepG 2.2.15 cells (`c±s，n=3) 乙肝表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎E抗原（HBeAg）是肝癌细胞株HepG2.2.15分泌到培养上清液中特异性的可溶性蛋白质，能够间接反映病毒复制状况。因此，通过检测用药后细胞上清液中HBsAg和HbeAg的活性，观察化合物1对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HbeAg的抑制作用，能够确定其体外抗乙型肝炎病毒的活性。结果显示，相对于阴性对照组，各浓度实验组所测A450 nm值均降低，且随着浓度的增加，降低愈明显。培养6 d后，化合物1 对HBsAg的IC50为4.37 mmol·L-1，TI为2.68；H12对HBeAg的IC50为4.89 mmol·L-1，TI为2.40。 通过现代分离技术和结构鉴定方法，从广西北仑河口采集从红树木榄（B. gymnorrhiza）胚轴中获得新的1个生物碱类单体化合物gymnorrhizin A。活性测试发现，化合物gymnorrhizin A具有抗HBV活性，对HbsAg和HBeAg的IC50分别为4.37 mmol·L-1（TI=2.68）和4.89 mmol·L-1（TI=2.40）。 BUNYAPRAPHATSARA N，JUTIVIBOONSUKA，SORNLEK P，et al，2003. 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[易湘茜，高程海，龙彬，等，2015.红树木榄胚轴中化学成分研究[J].中药材，38（1）：86-89.] 10种中草药提取物体外抗铜绿假单胞菌作用研究 谢俊杰1,2，韩 峻2，左国营1*，王 宁1，程子梦1,2 ( 1.成都军区昆明总医院天然药物研究中心，昆明650032；2.云南中医学院，昆明650500 ) 摘 要：通过对粗糠柴等10种中草药采用80%乙醇室温下浸渍制备的提取物进行体外抗铜绿假单胞菌及其耐药菌活性研究，并采取药敏纸片法测定临床分离菌株的耐药性。结果表明：这10种中草药80%乙醇提取物中，粗糠柴的乙酸乙酯层对铜绿假单胞菌标准菌及其耐药菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直径范围在10～17 mm之间，MIC范围在0.125～0.5 mg·mL-1之间，MBC范围在0.5～1 mg·mL-1之间；正丁醇层、水层的抑菌活性较乙酸乙酯层弱，石油醚层对铜绿假单胞菌没有效果。而小叶藤黄、滇南红厚壳、续随子的乙酸乙酯层，巴豆、罗汉松、肉桂醇提物对铜绿假单胞菌及其耐药菌株有较弱抗菌活性；滇南红厚壳的正丁醇层、续随子乙酸乙酯层以及大八角和郁金的醇提物对铜绿假单胞菌及其耐药菌株均无活性。从这些数据中可以得出，粗糠柴的乙酸乙酯层、正丁醇层和水层对铜绿假单胞菌及其耐药菌有较好的抑菌活性，尤以乙酸乙酯层活性最好，而粗糠柴的石油醚层没有活性。 关键词：中草药，粗糠柴，铜绿假单胞菌，MIC/MBC，抗菌活性 基金项目：国家自然科学基金（NSFC 81173504）[Supported by the National Natural Science Foundation of China (NSFC 81173504)]。 作者简介：谢俊杰（1990-），男，安徽六安人，硕士研究生，主要从事中草药抗耐药菌活性成分及耐药机制研究，(E-mail)xjj7294@163.com。 *通讯作者：左国营，博士，主任药师，博士后，硕士生导师，主要从事植物活性成分研究和天然药物开发, (E-mail)zuoguoying@263.net。 Abstract: To investigate the in vitro antibacterial activities of 80% ethanol extracts from 10 Chinese herbal medicines against Pseudomonas aeruginosa and its resistant strains, the drug-resistance spectrum of 7 P. aeruginosa stains isolated from the clinical sputum samples was determined by the Kirby-Bauer (K-B) method. The dried powder of the collected 10 Chinese herbal medicine samples were extracted with 80 % ethanol and the solvent was evaporated under reduced pressure to get the Chinese herbal medicines ethanol extracts. The ethanol extracts were suspended in deioned water, then petroleum ether, ethyl acetate, and n-BuOH were used to extract successively. The activities of each extract against P. aeruginosa were screened of inhibition zone diameters (IZDs) by the agar-diffusion methods, and the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were further determined by serial microdilution method. The data showed that of the 10 Chinese herbal medicines, the ethyl acetate extracts from Mallotus philippensis showed the most active against Pseudomonas aeruginosa and its resistant strains, with IZDs ranging by 10－17 mm, and the MICs and MBCs ranging by 0.125－0.5 mg·mL-1, respectively. The activities of n-BuOH and water extracts were slightly weaker, whereas the petroleum ether extracts showed no activities against P. aeruginosa and its resistant strains. The ethyl acetate extracts from Garcinia cowa, Calophyllum polyanthum and Euphorbia lathyris, together with the ethanol extracts from Croton tiglium, Podocarpus macrophyllus and Cinnamomum cassia showed slightly weaker activities against P. aeruginosa and its resistant strains. The n-BuOH extracts from Calophyllum polyanthum, ethyl acetate extracts from Euphorbia lathyris and ethanol extracts from Illicium majus, and Curcuma aromatic all showed no activities against P. aeruginosa and its resistant strains. We could made a conclusion from those data that the ethyl acetate, n-BuOH and water extracts from M. philippensi. Arg had effective antibacterial activities against P. aeruginosa and its resistant strains, especially the ethyl acetate extracts showing the best activitity, compared with the others extracts,whereas the petroleum ether extracts showed no activities against P. aeruginosa and its resistant strains. Key words: Chineseherbalmedicines,Mallotusphilippensi, Pseudomonasaeruginosa, MIC/MBC, antibacterial activity 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界和人体中，是导致院内感染的重要病原菌之一。在临床上常见于一些呼吸道感染、尿路感染和免疫力低下的病人的痰液和尿液中，甚至会引起严重的囊性纤维化病(cystic fibrosis，CF) (Pier，2002)。临床上常用的一些抗生素，铜绿假单胞菌都或多或少表现出耐药性（赵津彩和张跃栋，2013）。中草药因为具有不良反应小，资源丰富、价格低，作用位点相对较多，不易产生耐药性等特点而越来越受到药学和病原微生物研究者的关注。 本研究通过对粗糠柴等10种中草药进行体外抑菌活性研究，以筛选出来活性较好的中草药，为深入研究其活性单体化合物和作用机制打下物质基础。 1.1 材料 药材：粗糠柴（Mallotus philippensis）、小叶藤黄（Garcinia cowa）、续随子（Euphorbialathyris）、滇南红厚壳（Calophyllum polyanthum）肉桂（Cinnamomum cassia）、郁金（Curcumaaromatic）、巴豆（Crotontiglium）、罗汉松（Podocarpus macrophyllus）、大八角（Illicium majus）、水杨梅（Adinarubella）均为本实验室保存。 培养基：M-H（Mueller-Hinton）琼脂培养基和M-H肉汤培养基（杭州天河微生物试剂有限公司）。 试剂：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为工业级（重蒸后使用）；二甲基亚砜（DMSO）为分析纯，均购自昆明福海达化玻仪器有限公司。 菌株：标准菌为铜绿假单胞菌（ATCC27853）购自中国药物制品检定所；耐药菌株为PA135、PA216、PA276、PA281、PA291、PA314，PA319（从成都军区昆明总医院临床重症呼吸系统患者的痰液标本中分离得到），药敏纸片由温州市康泰生物科技有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 耐药菌株的鉴定 药敏测试按照抗菌剂药敏常用测试方法的K-B纸片扩散法（Kirby-Bauer法）进行。以Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）2012版（CLSI：M02-A11，2012）推荐方法为判断依据。 1.2.2 提取物的制备 将粗糠柴等药材粉碎成粗粉，用80%乙醇分别浸泡7、5、3、1 d，合并滤液，减压蒸发得到浸膏。浸膏用水分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层。减压回收得到各个萃取层的浸膏备用。 1.2.3 药液的制备 称取各待测药物，用1 mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成10 mg·mL-1的浓度，供打孔初筛使用；另取待测药用肉汤和5%DMSO溶解药物，制成16 mg·mL-1的溶液，用于测定MIC。 1.2.4 体外抑菌活性的测定 1.2.4.1 琼脂打孔法测定抑菌圈 配制菌液浓度为0.5麦氏单位的标准菌悬液浊度(1.5×108CFU·mL-1)。将已灭菌的M-H琼脂培养基倒入灭过菌的培养皿上（厚度约5 mm）。然后在培养基上用直径6 mm的无菌打孔器打孔。用无菌棉签蘸取适量的菌液挤去多余的液体后，均匀涂抹在打好孔的培养基表面。最后于每孔中加入50 μL制备好的药液，放置在（37±2）℃的恒温培养箱中培养24 h。 1.2.4.2 MIC的测定 微量稀释法测定MIC，均按照CLSI2012版指南进行（CLSI:M07-A9,2012）。 1.2.4.3 MBC的测定 确定MIC后，取MIC前3～5孔的培养物，接种到不含药的MH培养基上，在（37±2）℃恒温箱中培养24 h。采用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落数量，当菌落数少于5个的最小药物浓度即为此药的MBC（杨翠先等，2012）。 表1 7株耐药菌株的药敏实验结果Table 1 Drug sensitive test result of 7 resistant strains 2.1 7 株耐药菌株的药敏实验结果 通过对7株临床分离的铜绿假单胞菌的药敏试验检测，所测结果如表1。从表1可以看出，这7株菌株已对临床上常用的一些抗生素产生了耐药，而且表现出多重耐药的趋势。 2.2 10 种中草药提取物体外抑菌实验结果 从表2、表3和表4看出，粗糠柴的石油醚层对铜绿假单胞菌及其耐药菌株没有抑菌效果；乙酸乙酯层对标准铜绿假单胞菌和耐药菌株具有较好的抑菌效果，抑菌圈在10.5～18 mm之间；正丁醇层对标准铜绿假单胞菌和耐药菌株具有较好的抑菌效果，抑菌圈在12～16 mm之间；水层标准铜绿假单胞菌和耐药菌株具有较好的抑菌效果，抑菌圈在11～15 mm之间。说明粗糠柴的乙酸乙酯层、正丁醇层、水层、石油醚层的抑菌活性逐渐降低，而其他9种中草药对铜绿假单胞菌的标准菌株及其耐药菌株的抑菌效果较差。此外，这10种中草药还对标准金黄色葡萄球菌也有较好的抑菌效果。 本研究所使用的耐药菌株均是从本院临床重症患者的痰液中分离得到的，这7株耐药菌株对临床上现有使用的多种抗生素产生了耐药性。这提示我们在临床用药上应该充分结合药敏实验的结果合理用药，以提高治疗效果。 随着抗生素耐药问题的日益严重，现有抗生素的治疗效果日益降低。从天然药物中发现新的有效的化学成分已成为国内外的研究热点。在医院患者微生物感染中，革兰阴性菌的检出率明显高于革兰阳性菌，而且铜绿假单胞菌在检出的革兰阴性菌中居于首位(黄传正等，2015；李玉梅等，2015)，由此看出，革兰阴性菌感染在临床上是亟待解决的一问题。近年来铜绿假单胞菌耐药性的产生，给临床治疗带来严重挑战。武晓敏等（2014）通过对临床分离的711株铜绿假单胞菌的耐药性分析和分布情况分析，发现这711株菌株对头孢唑啉、复方大新诺明、头孢呋辛酯、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、呋喃妥因、头孢呋辛耐药率均达95.00%，且这711株菌株中，89.59%来自于痰标本。因此加大对抗铜绿假单胞菌的中草药活性成分的研究具有较大意义。本研究中，我们通过对粗糠柴10种中草药提取物对铜绿假单胞菌及其耐药菌株的抗菌活性筛选，在这10种中草药中，粗糠柴的乙酸乙酯层对铜绿假单胞菌的抑菌效果明显优于其他各个萃取层和其他中草药，为以后进一步追踪其抗菌成分提供了依据。粗糠柴在驱虫方面具有很好的效果，特别是在肠道绦虫方面的应用（Mayank et al，2013）；此外在抗炎止痛（Mohammad et al，2010）、抗血管生成（Giuseppe et al，2011）和抗氧化（Muhammad et al，2009）等方面也有一定效果。但是在抗菌方面，目前只有Syed et al（2009）报道过从粗糠柴中提取出一种成分对耐克拉霉素和甲硝唑的幽门螺杆菌有很好的抑菌效果，对铜绿假单胞菌的抑制作用及其活性成分还未见报道。蔡芸等（2007）研究发现大蒜素与头孢哌酮联用有协同抗铜绿假单胞菌的作用，可明显降低头孢哌酮的用量。国内外关于中草药与抗生素联用抗菌的报道(王春娟等，2014; Francisco et al，2013)，提示可以从联合用药方面来评价中草药的抗菌活性。根据本研究结果，通过进一步追踪活性成分，从粗糠柴中得到对铜绿假单胞菌有效的化学成分，为进一步研究其与抗生素联用抗铜绿假单胞菌的作用效果提供一定的指导作用。 表2 10种中草药提取物体外抑菌实验的抑菌圈直径Table 2 Inhibition zones diameters of 10 Chinese herbal medicines extracts in vitro antimicrobial activity (mm) 参考文献： CAI Y, NI SX, PEI F, et al, 2007. Antibacterial activity of allicin combined with cefoperazone against Pseudomonas aeruginosa [J]. Chin J Nosocominol, 17(12):1 559-1 561. [蔡芸,倪淑欣,裴斐,等, 2007.大蒜素与头孢哌酮联用对铜绿假单胞菌的药敏研究) [J].中华医院感染学杂志), 17(12):1 559-1 561.] 表3 10种中草药提取物对PAS及其耐药菌株体外抑菌MIC值Table 3 MIC of 10 Chinese herbal medicines extracts against PAS and its resistant strains (mg·mL-1) Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptility tests [S]. Approved Standard-Eleventh Edition M02-A11. Wayne, PA: CLSI2012. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptility tests [S]. Approved Standard-Eleventh Edition M07-A9. Wayne, PA: CLSI2012. FRANCISCO FMO, ALBA FT, THIALLY BG, et al, 2013. Efficacy of Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng in a murine of methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin abscesses [J]. Evid-based Compl Altern:1-9. GIUSEPPE V, ALESSANDRA P, CLAUDIA S, 2011. 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A new alkaloid (1) was isolated from the hypocotyl of a mangrove B. gymnorrhiza and purified by repeated column chromatography on silica and HPLC. The structure of Compound 1 was elucidated on the basis of extensive spectroscopic analysis (HRMS，1H NMR，13C NMR，DEPT，1H-1H COSY，HSQC and HMBC). Compound 1 was a new compound by the method of SciFinder scholar，and it showed that anti-Hepatitis B virus (HBV) activity against HbsAg and HbeAg with IC50values of 4.37 mmol·L-1and 4.89 mmol·L-1，and TI values of 2.68 and 2.40，respectively. The hypocotyl of a mangrove B. gymnorrhiza has been commonly used as crude material of herbal medicine for a long time，and this study would accumulate data for chemical constituents research of the genus. natural product research，alkaloid，HbsAg，HbeAg，therapeutic index Antibacterial activity screening of 10 Chinese herbal medicines against Pseudomonas aeruginosa in vitro XIE Jun-Jie1,2，HAN Jun2，ZUO Guo-Ying1*，WANG Ning1，CHENG Zi-Meng1,2 （1. Research Center for Natural Medicines, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command，Kunming 650032，China；2. Yunnan Traditional Chinese Medical University，Kunming 650500，China ) Q946.88，R914.4 A 10000-3142（2016）02-0236-04 10.11931/guihaia.gxzw201507009 陈志勇，曲彩红，卢静，等.木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究［J］.广西植物，2016，36(2)：236-239 CHEN ZY，QU CH，LU J，et al. Anew antiviral alkaloid from the hypocotyl of Bruguiera gymnorrhiza［J］. Guihaia，2016，36(2)：236-239 2015-07-11 2015-11-30 广西自然科学基金（2014GXNSFAA118048，2015GXNSFBA139195）；广西近海海洋环境科学重点实验室开放基金（GXKLHY13-06) [Supported by the Natural Science Foundation of Guangxi（2014GXNSFAA118048; 2015GXNSFBA139195）；Guangxi Open Fund For Key Laboratory of Marine Environmental Science（GXKLHY13-06）]。 陈志勇（1969-），男，江苏丹阳人，主治医师，主要从事肿瘤和病毒疾病及相关药物的研究，（E-mail）czyyy-1@126.com。 *通讯作者：高程海，博士，研究员，主要从事海洋药物研究，（E-mail）gaochenghai@gxas.cn。 中图分类号：Q946，R285.5 A 文章编号：1000-3142（2016）02-0240-06 DOI: 10.11931/guihaia.gxzw201502015 谢俊杰，韩峻，左国营，等. 10种中草药提取物体外抗铜绿假单胞菌作用研究［J］.广西植物，2016，36(2)：240-245 XIE JJ，HAN J，ZUO GY，et al. Antibacterial activity screening of 10 Chinese herbal medicines against Pseudomonas aeruginosa in vitro［J］. Guihaia，2016，36(2)：240-245 收稿日期：2015-02-15 2015-09-102结构鉴定和抗乙肝病毒活性测试
3结论
1材料与方法
2结果与分析
3讨论与结论
（1. Dalian Air Force Sergeant School of Communication，Dalian 116600，China; 2. Guangxi Key Laboratory of Marine Environmental Science，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007，China )
