复方参鹿颗粒治疗肾阳虚型再生障碍性贫血疗效观察及对CD4+T细胞亚群的影响

赵琳 邱仲川 陈珮 黄中迪 胡晓莹 朱小勤 瞿玮颖

摘要：目的 观察复方参鹿颗粒联合西药治疗肾阳虚型再生障碍性贫血（AA）临床疗效及对CD4+T细胞亚群的影响，探讨其作用机制。方法 将40例AA患者随机分为治疗组和对照组各20例。治疗组予复方参鹿颗粒联合西药治疗，对照组单用西药治疗。疗程均为6个月，随访1年以上。观察2组临床疗效及治疗前后外周血CD4+T细胞亚群变化。结果 治疗组临床疗效优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗后2组血细胞计数均较治疗前改善，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。治疗组治疗后红细胞计数、血红蛋白含量均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。与治疗前比较，治疗组治疗后CD4+CD25+细胞/CD4+细胞、CD4+CD25+FoxP3+细胞/CD4+CD25+细胞比例升高，Th1、Th2细胞比例降低，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组治疗后仅Th2细胞比例降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 复方参鹿颗粒可提高肾阳虚型AA治疗效果，其机制可能与减少Th1细胞数量、增加CD4+CD25+调节性T细胞数量、提高其FoxP3的表达有关。

关键词：复方参鹿颗粒；再生障碍性贫血；CD4+T细胞亚群

中图分类号：R259.565 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0020-04

Efficacy Observation of Fufang Shenlu Granule for Kidney-yang Deficiency Aplastic Anemia and Its Effects on CD4+ T Lymphocyte Subsets ZHAO Lin， QIU Zhong-chuan， CHEN Pei， HUANG Zhong-di， HU Xiao-ying， ZHU Xiao-qin， QU Wei-ying （Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM， Shanghai 200021， China）

Abstract： Objective To observe the clinical efficacy of Fufang Shenlu Granule for kidney-yang deficiency aplastic anemia （AA） and its effects on CD4+ T lymphocyte subsets， and explore its mechanism. Methods Forty AA patients were randomly divided into treatment group and control group， 20 cases in each group. The treatment group was treated with Fufang Shenlu Granule combined with conventional western medicine therapy， while the control group was only treated with conventional western medicine therapy. The treatment lasted for 6 months， and follow-up visits lasted for at least one year. The clinical efficacy and T lymphocyte subsets ratio changes before and after treatment in the two groups were observed. Results The clinical efficacy of treatment group was better than that of control group （P<0.05）. After treatment， the blood cell counts of the two groups were improved than those of before treatment （P<0.05， P<0.01）. After treatment， the red blood cell count and hemoglobin of treatment group were higher than those of control group （P<0.05）. Compared with the data before treatment in treatment group， the ratio of CD4+CD25+ cells in all CD4+ cells， and the ratio of CD4+CD25+FoxP3+ cells in all CD4+CD25+ cells increased （P<0.05）； the ratio of Th1 and Th2 cells in all CD3+CD4+ decreased （P<0.05）. The ratio of Th2 cells was lower than that before treatment in the control group （P<0.05）. Conclusion Fufang Shenlu Granule can enhance the treatment efficiency of AA with kidney-yang deficiency syndrome. The mechanism may be related to the decrease of Th1 cells， the increase of CD4+CD25+Tregs and their FoxP3 expression.

Key words： Fufang Shenlu Granule； aplastic anemia； CD4+ T lymphocytes subsets

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是免疫介导的以全血细胞减少为主要临床表现的骨髓衰竭性疾病。既往研究认为，CD8+T细胞介导的造血干细胞免疫损伤是AA发生的病理基础[1]。近年来研究发现，CD4+T细胞亚群在AA发病中发挥更重要的作用[2-3]。AA为临床常见的难治性血液系统疾病，中西医结合治疗该病的效果已得到认可。复方参鹿颗粒为本院院内制剂，该方重用温肾益髓药物，临床用于AA治疗20余年。本研究采用随机对照试验，进一步验证复方参鹿颗粒联合西药治疗AA疗效的可靠性，观察其对CD4+T细胞亚群的影响，探讨作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经本院医学伦理委员会批准，选择2012年5月-2014年12月在本院血液科就诊的AA患者40例。采用随机数字表将入组患者分为治疗组和对照组各20例。治疗组男10例，女10例；年龄18～70岁，平均（47.25±12.80）岁；病程最短3个月，最长30年，平均（1.82±1.25）年；初治17例，复治3例；重型AA 7例，轻型AA 13例。对照组男11例，女9例；年龄20～70岁，平均（43.50±19.32）岁；病程最短2个月，最长28年，平均（1.95±1.78）年；初治15例，复治5例；重型AA 8例，轻型AA 12例。2组患者性别、年龄、病程、血象、骨髓象方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 诊断与纳入标准

符合《血液病诊断及疗效标准》AA诊断标准[4]和《中药新药临床研究指导原则（试行）》AA肾阳虚证诊断标准[5]，并签署知情同意书。

1.3 排除标准

①有明显兼夹证或合并证者。②年龄在18岁以下或70岁以上，妊娠期或哺乳期妇女，过敏体质及对本药过敏者。③合并严重心、脑、肝、肾疾病及精神病患者。④未按规定用药，无法判断疗效，或资料不全等影响疗效或安全性判断者。⑤参加其他临床研究者。

1.4 治疗方法

2组均予司坦唑醇片（广西南宁百会药业集团有限公司，批号1201015），6～8 mg/d，分2～3次口服。重型AA者加用环孢霉素A（杭州中美华东制药有限公司，批号120932），3～6 mg/（kg·d），分早晚2次口服，血药浓度维持在100～300 ng/L。治疗组同时予复方参鹿颗粒（本院院内制剂，沪药制字Z06100005，由本院药剂科制备，批号20120302），每次12 g，每日3次，开水冲服。2组疗程均为6个月。随访1年以上。

2组均予支持治疗：如血红蛋白<60 g/L，予红细胞悬液输注；如血小板计数<5.0×109/L（无出血危险因子）或<20.0×109/L（有明显出血倾向或存在出血危险因子），予血小板悬液输注及对症止血治疗；如合并感染，根据感染部位及严重程度及时给予有效抗感染治疗。

1.5 观察指标

1.5.1 外周血细胞计数 每2周用COULTER LH750全自动血细胞分析仪检测1次。

1.5.2 CD4+T细胞亚群比例 分别于治疗前后采用BD FACScantoII流式细胞仪检测CD4+T细胞亚群1次。所用单克隆抗体CD3-PerCp、CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE、IL-17-PE、IFN-γ-PE、IL-4-PE及其同型阴性对照抗体均购自BD pharmingen公司，破膜/固定剂购自eBioscience公司，佛波酯和离子霉素购自Sigma公司。用CellQuest软件分析数据。

1.6 疗效标准

根据《血液病诊断及疗效标准》[4]判断临床疗效。基本治愈：贫血和出血症状消失，血红蛋白男性达120 g/L、女性达110 g/L，白细胞达4×109/L，血小板达100×109/L，随访1年以上未复发。缓解：贫血和出血症状消失，血红蛋白男性达120 g/L、女性达100 g/L，白细胞达3.5×109/L左右，血小板有一定程度增加，随访3个月病情稳定或继续进步。明显进步：贫血和出血症状明显好转，不输血，血红蛋白较治疗前1个月内常见值增长30 g/L以上，并能维持3个月。判定以上3项疗效者均应3个月内不输血。无效：经充分治疗后，症状、血象未达明显进步。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料用—x±s表示，计数资料用频数表示。计量资料满足正态分布且方差齐性，组间比较采用成组t检验，同组治疗前后比较采用配对t检验。若资料呈偏态分布，进行相应的变量变换后呈正态分布且方差齐性者采用t检验，若变换后仍不服从正态分布或方差仍不齐，采用非参数的秩和检验。等级资料组间比较采用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组临床疗效比较

治疗组基本治愈3例，缓解7例，明显进步7例，无效3例；对照组基本治愈1例，缓解4例，明显进步8例，无效7例。治疗组疗效优于对照组，差异有统计学意义（Z=-2.129，P=0.040）。

2.2 2组治疗前后外周血细胞计数

治疗前2组外周血细胞计数比较差异无统计学意义（P>0.05），治疗后2组血细胞计数均较治疗前改善（P<0.05，P<0.01）。治疗后治疗组红细胞计数、血红蛋白含量均高于对照组（P<0.05）。结果见表1。

2.3 2组治疗前后外周血CD4+T细胞亚群分析

2组分别有16例患者进行了CD4+T细胞亚群检测。治疗前2组CD4+T细胞亚群比例比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组治疗后CD4+CD25+细胞/CD4+细胞、CD4+CD25+FoxP3+细胞/CD4+CD25+细胞比例较治疗前升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

治疗组治疗后Th1、Th2细胞比例较治疗前降低，对照组仅Th2细胞比例较治疗前降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

AA是由于效应T细胞的过度激活导致造血组织衰竭的一种自身免疫性疾病，以贫血、出血和感染为主要临床表现，属于中医“虚劳”“髓劳”等范畴。以“肾虚为本”论治已得到多数医家的认同。我们认为，生化之道，阳居主位，“邪之所凑，其气必虚”，肾中阳气亏虚，则卫外不固，营不内守，气不摄血，血不循经，故AA易继发感染和出血；在感染和出血之后，由于火热和亡血耗气伤阴，可见阴血亏虚或阴阳俱虚症状。“损者益之，劳者温之”（《素问·至真要大论篇》），“补气在补血之先……而养阳在滋阴之上”（《医宗必读》），对气血阴阳俱损之虚劳AA治宜温阳益气为先。复方参鹿颗粒重用红参须、鹿角片、附子等药物温阳益气以促进骨髓造血恢复。阳附于阴，阳生阴长，故以熟地黄、龟甲等滋补肾阴药物同用，既可达到阳得阴助则生化无穷之效，又可去除温阳药物耗伤阴血之弊。本研究结果显示，对于辨证属肾阳虚型AA，以复方参鹿颗粒联合西药治疗，可有效改善AA患者外周血象，疗效优于单用西药组，尤其是对红细胞、血红蛋白有显著提高作用，其中治疗组治疗后的血红蛋白量接近正常。

免疫机制异常是AA关键的发病机制，而CD4+T细胞是这种免疫反应发生的重要驱动者和参与者。CD4+T细胞包括IFN-γ–producing CD4+T细胞（Th1细胞）、IL-4–producing CD4+T细胞（Th2细胞）、调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）、IL-17–producing CD4+T细胞（Th17细胞）等，Th1和Th2、Th17和Tregs在分化及功能上相互拮抗，在自身免疫疾病的发生发展中起着重要的作用[6]。

有研究发现，与正常对照比较，AA患者存在Th1细胞数显著增加，而Th2细胞数无变化，导致Th1细胞反应亢进，造血负调控因子产生增加，骨髓正常造血受抑[7]。但也有研究发现，AA患者Th1、Th2细胞数量均显著高于正常对照，Th1细胞数量与疾病严重程度不相关，而Th2细胞数量增加仅见于重型、极重型AA[2]，可能由于重型AA的Tregs数量显著减少，诱导Th2细胞凋亡功能障碍[8]。本研究结果显示，治疗组治疗后Th1、Th2细胞比例均降低，可能与本研究纳入了重型AA有关。虽然Th1/Th2比值同时也呈下降趋势，但差异并无统计学意义。

与健康人群相比，AA患者存在Tregs数量减少，转录因子FoxP3蛋白和mRNA表达水平显著下降，和疾病严重程度相关[9]。Tregs数量减少、功能障碍，免疫耐受调节功能受抑，导致效应T细胞的异常增殖活化，是AA发生的主要原因之一。AA残存造血组织中IL-17+T细胞数量增多，而治疗有效者Th17细胞比例及绝对值较治疗前明显减低，并且与Tregs数量存在负相关[10]。但也有研究发现，AA患者外周血Th17细胞数量及其特异性转录因子RORC的表达并无增加，提示Th17免疫应答在AA发病中的作用可能并不重要[11]。在本研究中，治疗组经治疗后，CD4+CD25+Tregs比例显著上升，FoxP3表达增加，而Th17细胞数量与治疗前相比并无明显改变，与Tregs数量并不存在负相关。

CD4+T细胞各亚群之间存在复杂的相互作用，其与AA发病的关系仍有许多疑问未阐明。在本研究中，我们发现，复方参鹿颗粒至少可以降低AA患者Th1细胞比例，改善Th1细胞极化，增加CD4+CD25+Tregs的数量，提高其FoxP3的表达，从而增强Tregs的免疫抑制功能，而对Th17细胞无明确的作用。但是，复方参鹿颗粒是否对Th1细胞有直接的抑制和逆转作用，亦或通过增强Tregs的免疫抑制功能来改善Th1细胞极化，尚待进一步研究。

参考文献：

[1] LI J P， ZHENG C L， HAN Z C. Abnormal immunity and stem/progenitor cells in acquired aplastic anemia[J]. Crit Rev Oncol Hematol， 2010，75（2）：79-93.

[2] KORDASTI S， MARSH J， AL-KHAN S， et al. Functional characterization of CD4+ T cells in aplastic anemia[J]. Blood，2012，119（9）：2033- 2043.

[3] 史月，李建平，李文倩，等.CD4+ T细胞亚群在再生障碍性贫血中的作用及机制[J].细胞与分子免疫学杂志，2015，31（9）：1287-1291.

[4] 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].北京：科学出版社，2007：20-21.

[5] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[M].北京：中国医药科技出版社，2002：178.

[6] HOYER K K， KUSWANTO W F， GALLO E， et al. Distinct roles of helper T-cell subsets in a systemic autoimmune disease[J]. Blood，2009， 113（2）：389-395.

[7] DU H， WANG Q， JI J， et al. Expression of IL-27， Th1 and Th17 in patients with aplastic anemia[J]. J Clin Immunol，2013，33（2）：1-10.

[8] TIAN L， ALTIN J A， MAKAROFF L E， et al. Foxp3+ regulatory T cells exert asymmetric control over murine helper responses by inducing Th2 cell apoptosis[J]. Blood，2011，118（7）：1845-1853.

[9] SHI J， GE M， LU S， et al. Intrinsic impairment of CD4+CD25+ regulatory T cells in acquired aplastic anemia[J]. Blood，2012， 120（8）：1624-1632.

[10] DE LATOUR R P， VISCONTE V， TAKAKU T， et al. Th17 immune responses contribute to the pathophysiology of aplastic anemia[J]. Blood， 2010，116（20）：4175-4184.

[11] ZHANG J， WU Q， YAO J， et al. Basal level of Th17 immune response is not enhanced in aplastic amemia[J]. Cytokine，2015，74（2