千年健寒热药性的实验评价

王　征，刘建利，唐志书*，宋忠兴

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室

陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712083；

2.西北大学生命科学学院 西部资源与现代生物技术教育部重点实验室，西安 710069)



千年健寒热药性的实验评价

王征1，刘建利2，唐志书1*，宋忠兴1

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室

陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712083；

2.西北大学生命科学学院 西部资源与现代生物技术教育部重点实验室，西安 710069)

摘要：目的通过前期建立的中药寒热药性的细胞评价方法评价中药千年健的寒热药性。方法用噻唑蓝(MTT)比色法考察千年健对SGC-7901细胞体外增殖的影响，倒置显微镜观察千年健对细胞形态特征的影响，台盼蓝染色法分析千年健的细胞毒作用。结果千年健在5 μg/mL(含5 μg/mL)以下对细胞生长有促进作用。形态学观察表明千年健在5 μg/mL(含5 μg/mL)以下使细胞密度增加，细胞结构致密、生长旺盛。台盼蓝染色表明千年健对这2种细胞没有细胞毒作用。结论千年健药性应为温热，且对所用细胞没有细胞毒作用。

关键词：千年健；寒热药性；MTT法；SGC-7901细胞；台盼蓝染色

千年健始载于《本草纲目拾遗卷五》，为天南星科多年生草本植物千年健Homalomenaocculta(Lour.)Schott的根茎[1]。《本草再新》言其味苦，性寒。《中药学》认为其味苦，性温[2]。上述文献表明对千年健寒热药性的认识存在分歧，为了对其寒热属性有一个客观的认识，有必要进行实验研究。本实验室在前期的工作中，基于细胞模型建立了评价中药寒热药性的方法[3-5]。该方法基于温热药可以使生物体的生理功能亢奋，而寒凉药则使得生物体生理功能表现为抑制[6]。用动物模型也可得出同样的结论，即用寒药造模可以使动物的体温降低，中枢兴奋抑制以及代谢减慢，而热药的作用则相反[7-8]。由此可以推测，寒热药对生物体最小的组成单位细胞也应该有一定的影响，即寒药会抑制细胞的生长增殖,而热药则会表现出促进作用。在前期的工作中已经验证了这一想法，已用本法对野菊花、白头翁、丹参及白薇等寒热药性文献记载不一的中药药性进行了实验评价。本文用MTT法对寒热药性进行评价，MTT进入活细胞后被线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的甲臜(Formazan)结晶并在细胞中沉积。结晶可以被二甲基亚砜(DMSO)溶解，并在490 nm波长处具有最大吸收，以此间接反映活细胞数量[9]。台盼蓝染色(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的方法。由于细胞死亡后细胞膜的完整性丧失，通透性增加，因此细胞可以被台盼蓝染成蓝色，而活细胞由于细胞膜的存在而使得台盼蓝难于进入细胞内。经染色后的细胞可以通过显微镜观察，经细胞计数对细胞存活率进行比较精确地分析。

1材料

1.1细胞株人胃癌细胞株SGC-7901，由第四军医大学提供。1.2实验仪器μQuant 酶标仪(美国Bio-Tek)、CO2培养箱(Sanyo公司)、细胞96孔培养板、普通倒置光学显微镜、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3药品与试剂千年健(购自西安藻露堂医药超市,经西北大学生命科学学院房敏峰高级工程师鉴定为正品药材)、HyClone改良型RPMI-1640培养液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)、四季青无支原体胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、PBS(磷酸缓冲液)、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎国生物技术有限公司)、台盼蓝染料(西安沃尔森生物技术有限公司)。

2方法

2.1受试药品溶液的制备称取千年健20 g,煎煮3次,30 min/次,合并煎液,浓缩,定容至20 mL,质量浓度为1 g/mL。药液10 000 r/min,离心30 min,上清液用0.22 μm的微孔滤膜滤过,无菌水稀释至10 mg/mL,备用。

2.2细胞培养将SGC-7901细胞在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液(pH 7.0～7.4)、37 ℃恒温培养箱中、5%CO2及饱和湿度条件下进行传代培养。

2.3MTT试验取对数生长期、密度为5×107/L的SGC-7901细胞接种于含200 μL RPMI-1640培养基的96孔板上,置于恒温培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后更换新鲜培养液(200 μL/孔),实验组设8个浓度梯度，分别为2、5、10、20、50、100、200、400 μg/mL，每个浓度设3个重复孔。加药完毕后96 孔板置于恒温培养箱中培养48 h后更换培养基(180 μL/孔),然后加入新鲜配制的MTT溶液(5 g/L)20 μL。继续培养4 h后，吸弃上清液,每孔加入150 μL DMSO,在37 ℃恒温摇床上震荡10 min(60次/min)后，测定490 nm处吸光度(A)值。按下列公式计算细胞抑制率[10]，实验重复3 次。

2.4台盼蓝染色参照2.3中步骤将对数生长期细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后接种于96孔板培养48 h后，更换新鲜培养基,每孔加入20 μL、0.4%的台盼蓝染液,作用5 min后在普通光镜下观察。

3结果

3.1MTT法检测用MTT法分别检测千年健在2～400 μg/mL浓度范围内SGC-7901细胞体外增殖的影响见表1。

表1　 千年健对SGC-7901细胞体外增殖的影响

注：与对照组比较，#P<0.05，## P<0.01

从表1可以看出，千年健浓度为2、5 μg/mL时，可以促进SGC-7901细胞的增殖。在2 μg/mL浓度下促进作用显著，抑制率为17.52%，而随着浓度的增大促进作用逐渐减弱，在5 μg/mL浓度下几乎对细胞的生长增殖不起作用。而当浓度大于5 μg/mL时则对SGC-7901细胞的生长增殖表现出抑制作用。为了能更加直观的看出千年健对SGC-7901细胞的抑制率随浓度变化的趋势，以抑制率对浓度作图，所得曲线见图1。

图1　千年健对SGC-7901细胞增殖抑制率变化

从图1中可以直观的看到千年健对SGC-7901细胞增殖的作用随浓度从低到高而表现为先促进后抑制，抑制作用与浓度的增大有关，并且随着浓度的进一步增大，抑制作用还会加强。根据笔者以前所得实验结果判断，千年健性温热。此与《中药学》所述一致，并为《中药学》所述提供了有力的实验证据支撑。

3.2千年健对SGC-7901细胞形态的影响观察对照组与加药组在倒置显微镜下的观察拍照的照片。

选取2、400 μg/mL浓度下的细胞照片与空白对照组照片比较。可以清楚的看到与空白对照组相比较，2 μg/mL浓度下的细胞密度增加，而400 μg/mL浓度下细胞密度明显降低，细胞形态也发生变化。正常的SGC-7901细胞呈不规则的多边形，细胞核膜、核仁轮廓明显，细胞延展且扁平。在2 μg/mL浓度下细胞形态良好，结构致密，生长旺盛。而400 μg/mL处细胞密度明显下降，细胞变圆，细胞颗粒感增加。

3.3台盼蓝染色SGC-7901细胞经台盼蓝染色后均未见有着色细胞，说明千年健在本实验所选浓度范

围内对SGC-7901细胞没有细胞毒作用。

4结论

千年健作为一种传统的中药，历来对其寒热药性说法不一。《本草再新》言其味苦，性寒，而《中药学》认为其性温。寒热药性多是历代医家根据自己的用药经验总结而来，长期以来缺少一个科学的评价寒热药性的实验方法，因而无法形成统一的认识。依据所建立的评价中药寒热药性的方法，通过MTT法检测了千年健对SGC-7901细胞体外增殖的影响，在低浓度下千年健对SGC-7901细胞的增殖表现为促进作用，而当浓度大于5 μg/mL时则表现出抑制作用。且经过台盼蓝染色观察到千年健对SGC-7901细胞不产生细胞毒性。根据热药可能会促进细胞生长、增殖，而寒药会表现为抑制，可以得出千年健性温热这一科学的结论。这与《中药学》所载一致，并且为《中药学》的观点提供了科学的实验证据支撑。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:1部[M].北京:化学工业出版社,2005:31.

[2]颜正华.中药学[M].北京:人民卫生出版社,2006:354.

[3]程微微,刘建利,张宁,等.评价中药寒热药性的实验方法研究[J].中草药,2010,41(7):1122-1126.

[4]王征,张宁,刘建利.采用两种细胞模型评价野菊花的寒热属性[J].中草药,2012,43(8):1586-1589.

[5]王征,刘建利.白头翁寒热药性的试验评价[J].药物评价研究,2013,36(5):359-362.

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[7]梁月华.寒热本质研究进展[J].中医杂志,1996,37(12):747-750.

[8]袁永明,陈晓,潘志强,等.寒证热证大鼠模型的红外热图研究[J].辽宁中医杂志,2008,35(5):78-85.

[9]边兴艳.MTT比色法及其应用[J].国外医学(临床生物学与检验学分册),1998,19(2):83- 85.

[10]YE Hong,WANG Keqi,ZHOU Chunhong,et al.Purification,antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharides from the brown seaweed Sargassum pallidum [J].Food Chem,2008,111(2):428-432.

Evaluating cold and hot characteristic ofHomalomenaocculta(Lour.) Schott by experimental method

WANG Zheng1,LIU,Jianli2,TANG Zhishu1*,SONG Zhongxing1

(1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Shaanxi province key laboratory of new drugs and Chinese medicine foundation research,Shaanxi rheumatism and tumor center of TCM engineering technology research,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712083,China;2.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract:ObjectiveEvaluate the cold and hot characteristic of Homalomena occulta (Lour.) Schott by cellular models.MethodsMTT assay was used to investigate the effect of Homalomena occulta (Lour.) Schott on the growth of SGC-7901 in vitro.Morphological changes of SGC-7901 treated with Homalomena occulta (Lour.) Schott were observed through invert microscope.Trypan-blue staining was used to analyze the cytotoxicity of Homalomena occulta (Lour.) Schott.ResultsHomalomena occulta (Lour.) Schott can promote the growth and proliferation of SGC-7901 in the concentration range of 2-5 μg/mL.Morphological observation showed Homalomena occulta (Lour.) Schott could increase the density of SGC-7901 in the same concentration range.Trypan-blue staining showed Homalomena occulta (Lour.) Schott had no cytotoxicity on SGC-7901.ConclusionThe results reveal in this work that Homalomena occulta (Lour.) Schott shows a hot or warm characteristic and have no cytotoxicity.

Keywords：Homalomena occulta (Lour.) Schott;cold and hot characteristic;MTT assay;SGC-7901;trypan-blue staining

(收稿日期:2015-09-25)

文章编号：2095-6258(2016)02-0266-03

中图分类号：R285.1

文献标志码：A

*通信作者：唐志书，教授，电子信箱-tzs6565@163.com

作者简介：王征(1980-)，男，中药学博士，讲师，主要从事中药活性成分的仿生合成与结构修饰研究。

基金项目：国家自然科学基金(20872118);教育部博士点基金(20070697012);陕西省重点科技创新团队(2012KCT-20)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.016