不同刺激量针刺关元穴对寒凝类痛经模型大鼠的影响

崔　晓，周　瑾，张　梅，刘珍珍，杨佳敏，齐丹丹，郭孟玮，2，赵雅芳，2，李晓泓，任晓暄，2，张露芬，2*

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.国家中医药管理局针灸生物学三级实验室，北京 100029)



不同刺激量针刺关元穴对寒凝类痛经模型大鼠的影响

崔晓1，周瑾1，张梅1，刘珍珍1，杨佳敏1，齐丹丹1，郭孟玮1，2，赵雅芳1，2，李晓泓1，任晓暄1，2，张露芬1，2*

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.国家中医药管理局针灸生物学三级实验室，北京 100029)

摘要：目的观察不同的针刺刺激量施于关元穴对寒凝类痛经模型大鼠子宫组织中收缩素受体(OTR)及肌球蛋白轻链激酶(MLCK)含量的影响。方法将处于动情间期3月龄的SD雌性大鼠32只，随机分为盐水组、寒凝类痛经模型组24只,造模成功后将寒凝类痛经模型组又分为模型组、刺激量A组和刺激量B组，每组8只。除盐水组外，模型组、刺激量A组和刺激量B组均采用全身冷冻法结合苯甲酸雌二醇注射法造模。盐水组和模型组不予针刺，刺激量A组予以粗针、深刺、行手法；刺激量B组予以细针、浅刺、不施手法。采用荧光定量PCR方法检测大鼠子宫组织中缩宫素受体(OTR)的含量。采用ELISA(酶联免疫法)测量大鼠子宫组织中MLCK的含量。结果与盐水组比较，模型组的子宫收缩波个数、波峰峰值、活动度及MLCK水平均升高 (P<0.01)；与模型组比较，刺激量A组的子宫收缩波个数明显减少(P<0.05)、MLCK含量明显降低 (P<0.01)，刺激量B组的OTR mRNA相对表达量降低 (P<0.05)；与刺激量A组比较，刺激量B组收缩波个数增多 (P<0.05)、OTR mRNA相对表达量降低(P<0.01)。结论不同刺激量针刺关元穴对寒凝类痛经模型大鼠的效应有所不同，粗针、深刺、行手法的效应较强于细针、浅刺、不行手法的针刺效应，提示针刺的刺激量也是决定针刺疗效的因素之一。

关键词：针灸疗法；穴，关元；寒凝类痛经；OTR；MLCK

痛经是目前临床常见的妇科疾病之一，也是以在行经前后或行经期间出现腹痛，痛引腰骶，下腹坠胀等为主要表现的月经病之一。其发病所引发的不适会严重影响多数女性患者的生活和工作质量，因此其越来越受医学者的关注。现代针灸疗法在治疗痛经疾病中疗效确卓[1-2]，成为痛经主要的治疗手段之一和重点研究方向。由于针灸在治疗疾病方面的机制尚不清楚，现对针刺关元穴从不同刺激量入手，观察其对寒凝类痛经模型大鼠子宫相关物质的影响，探讨不同刺激量对针刺镇痛效应的影响差异及部分机制。

1材料

1.1动物采用清洁级(SD)大鼠，雌性，鼠龄3个月，体质量(240±20)g，性成熟未交配。饲养条件：室内温度(23±1)℃，湿度(45±5)%，日光灯光照，普通清洁级鼠饲料，自由饮用自来水。在饲养过程中对大鼠进行阴道筛查，选择处于动情间期的大鼠32只，纳入实验。

1.2仪器、试剂及耗材BC/BD-379HB卧式冰柜:青岛海尔集团；BT223S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；电热恒温水浴箱，北京市医疗设备厂；MDF-u50A型超低温冰箱，日本三洋公司；FT-100张力换能器，成都泰盟科技有限责任公司；PRISM7700 型荧光定量 PCR仪，美国应用生物公司；苯甲酸雌二醇注射液，宁波市三生药业有限公司，批号:120207；缩宫素注射液：上海禾丰制药厂生产，批号：120302；自制美兰染色溶液；20%乌拉坦注射液：批号T20080530。

2方法

2.1实验动物适应性饲养1 周后，对大鼠进行阴道动情周期筛查,每日定时用细棉签蘸以生理盐水湿润后轻轻插入大鼠阴道约0.5 cm，稍微转动后取出，将带有阴道内容物的细棉签在载玻片上均匀转动涂片，在空气中干燥。美兰染色10 min，用清水将美兰轻轻冲掉，然后在显微镜下观察阴道涂片的组织学变化，根据细胞形态、种类及数量筛选出动情间期大鼠。将处于动情间期的32只雌性SD 大鼠，按照随机数字法分为盐水对照组 8 只，寒凝证类痛经模型组24只，造模结束后将寒凝类痛经模型组分为模型组、刺激量 A 组(粗针、深刺、行手法) 与刺激量B组(细针、浅刺、不施手法)，每组各8 只。

2.2模型制备根据前期本课题组实验研究，采用动情间期SD大鼠全身冷冻法配合苯甲酸雌二醇注射法可成功建立寒凝类痛经大鼠模型[3-5]。其制备方法为:除盐水组外，其余各组大鼠采用全身冷冻法制备寒凝证模型，即第1～5天将大鼠(每8只1笼) 放入-25 ℃冰柜冷冻4 h，2 h后打开冰柜换气5 s，同时给予苯甲酸雌二醇注射，第1天及第10天日注射 0.5 mg /只，余日均0.2 mg /只，盐水组每日给予同等剂量的生理盐水。模型组及针刺组于末次给药1 h后，腹腔注射缩宫素2 U/只，盐水组在皮下给予生理盐水1 h 后，腹腔注射生理盐水2 U/只。2.3穴位选取与定位根据大鼠形态、解剖以及生理特点，参照张露芬主编《实验针灸学》穴位标准定位，“关元”：在大鼠脐(两髂棘连线的中点)下约25 mm处。2.4针刺方法针刺组和模型组在第10天注射缩宫素后，刺激量A组用Φ 0.25 mm×40 mm毫针针刺大鼠关元穴4～5 mm，且刺入即刻和留针10 min时分别施平补平泻手法30 s；刺激量B组用Φ 0.18 mm×13 mm毫针针刺大鼠关元穴1～2 mm，不行手法。2组均留针20 min。模型组和盐水组不予针刺处理。

2.5指标检测

2.5.1子宫收缩强度第10天注射苯甲酸雌二醇后，将大鼠予以肌注20%乌拉坦溶液，大鼠麻醉后，手术切开腹部，寻找子宫“Y”型交叉处，在一侧子宫的分叉上1 cm处穿线，线的另一端连接于张力传感器上，加0.1 g的负荷，用BL-420F生物机能实验系统记录仪记录子宫的收缩波，首先记录其在5 min内的基础波形，然后将2 U缩宫素滴在子宫上，继续标记，针刺组需分别标记针刺即刻、针刺时、针刺20 min结束，停止标录，记录子宫收缩波个数、子宫收缩波峰值及子宫活动度(子宫收缩波个数×波峰峰值)。

2.5.2荧光定量法检测子宫OTR水平的表达1)子宫组织提取：取大鼠的子宫，称重，放入EP管中，置液氮冻存5 min后，置于-80 ℃冰箱内保存待测。2)RNA提取：RNA 提取按 Trizol 提取试剂盒操作说明书进行。EP管于室温内解冻1 h后,于自动振荡器上震荡1 min后常温放置10 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温孵育2～3 min；12 000 r/min离心15 min；取上清液至新 EP管内,加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀后，常温静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清液；75% 冷乙醇洗涤沉淀1次，7 500 r/min离心5 min，弃乙醇，空气或真空干燥10 min；加 DEPC 处理水溶解RNA 10 min，提取的RNA纯度由OD260/280鉴定。3)cDNA 制备：根据Promega ImProm-IITMReverse Transcription System试剂盒加入随机引物及模板引物进行逆转录，在PCR仪上设置反应条件为：25 ℃ 5 min；42 ℃1 h；70 ℃15 min，终止反应取出。冰浴冷却后置-20 ℃ 保存。4)荧光定量 PCR反应：根据NCBI数据库中OTR及β-actin基因序列，以Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京生工生物工程(上海)股份有限公司合成(OTR引物上游5’-TTGCTGGGCGGTCTTCAT-3’下游5’-TCATCTTCACCGTGCGGATTT-3’产物长度269 bp；内参β-actin引物上游5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’下游5’-CGTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG-3’产物长度283 bp)。按以下反应体系进行:25 μL PCR反应体系中含 Taq酶0.2 μL，10 xbuffer 2.5 μL,cDNA 4μL，dNTP 0.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5μL,去离子水16.8 μL。扩增条件为 95 ℃ 3 min 预变性,94 ℃ 30 s变性，(退火温度)×30 s退火(OTR 58 ℃、β-actin 59 ℃)，72 ℃ 1 min延伸，共 40 个循环，最后是72 ℃延伸7 min。

2.6子宫中MLCK阳性水平表达的检测采用ELISA(酶联免疫法)测量大鼠子宫组织中MLCK的表达水平。严格按试剂盒说明书操作程序。

3结果

3.1不同刺激量针刺关元穴对寒凝类痛经模型大鼠子宫收缩强度的影响见表1。

组 别收缩波个数/个波峰峰值/g活动度/(个/g)盐水组 6.00±3.63 0.13±0.05 0.75±0.41 模型组 12.75±4.43##0.36±0.25##4.23±2.42##刺激量A组7.88±2.36△ 0.32±0.21# 2.14±0.81##刺激量B组10.63±2.26#▲0.37±0.21##4.09±2.61##

注：与盐水组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与刺激量A组比较，▲P<0.05

3.2不同刺激量针刺关元穴对寒凝类痛经模型大鼠子宫OTR、MLCK的影响见表2。

组 别OTRmRNA相对表达量(2-△△Ct)MLCK/(pg/mg)盐水组 4.59±0.92 9.13±1.69 模型组 3.50±10.84 12.69±1.75##刺激量A组4.69±1.40 10.49±0.93△△刺激量B组2.23±1.47##△▲▲11.29±1.32##

注：与盐水组比较， ##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与刺激量A组比较，▲▲P<0.01

4讨论

痛经是临床上较为常见的妇科病之一[6]，而从中医辨证角度分析，寒湿凝滞导致胞宫气血瘀滞是目前临床痛经发病的主要病机之一[7-8]，本课题前期大量研究证实全身冷冻法加苯甲酸雌二醇联合缩宫素可成功制备寒凝类痛经模型大鼠，且该模型所表现的表征特点均较为符合中医寒凝证的证候特征[9-10]。故本实验选择寒凝类痛经模型大鼠为研究媒介，探讨不同刺激量对针刺疗效的影响。

关元穴是任脉与足三阴经的交会穴，具有培元固本、温阳散寒、调补冲任的功效，临床上多用于生殖系统疾病。《类经图翼》中提到“此穴又名大中极，乃男子藏精，女子蓄血之处……主治积冷，诸虚百损，脐下绞痛，渐入阴中等。”此穴又为小肠之募穴，可集聚小肠经气血，传导任脉水湿，可通利任脉，通则不痛。现代临床和实验研究[11-12]均表明，关元穴可有效改善经期伴随的一系列不适症状。因此本实验选择针刺关元穴作为干预手段，初步探讨不同刺激量对针刺疗效的影响。

痛经明显的病理表现即为子宫平滑肌的异常收缩，这也是疼痛产生的主要原因之一。而在这一病理过程中，子宫平滑肌细胞上的缩宫素受体(OTR)可通过与缩宫素结合升高胞内Ca+浓度，发挥收缩子宫平滑肌的作用。继而Ca+浓度的改变可调控MLCK活性，使其磷酸化，引发肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，从而起到使子宫平滑肌收缩的作用[13-14]。在这一连锁反应当中，缩宫素受体(OTR)与肌球蛋白轻链激酶(MLCK)均是关键因素之一，随着MLCK和OTR增加，肌丝运动速度增强，平滑肌收缩增强[15-16]。故本实验观察OTR与MLCK阳性表达水平的变化特点，用以揭示不同刺激量下针刺对寒凝类痛经的影响机制，并进一步阐释针刺刺激量对针刺效应的影响。

本实验结果显示：针刺关元穴可以明显减少寒凝类痛经模型大鼠的子宫收缩波个数，有效抑制子宫活动度的异常增强。不同的刺激量下，子宫的收缩波、收缩波波峰峰值、子宫活动度、子宫MLCK的含量均有不同程度的降低，提示针刺关元穴对子宫收缩强度具有一定的良性调节作用，并且刺激量A组的效应表现优于刺激量B组。然而在本实验结果中OTR mRNA的相对表达量与实验结论呈现相反的表现趋势，这种异常表现可能与子宫内在调节机制有关，有关报道[17]曾提示，长时间的收缩素(OT)刺激会出现OTR脱敏现象，故而在机体调节中，也可能会因为长时间疼痛反应的刺激，外加本实验造模过程中注射缩宫素，诱发此现象产生，导致OTR mRNA相对表达量呈现异常表达。也有可能因为子宫内膜和子宫平滑肌均存在收缩素受体(OTR)，而不同的环境刺激会诱导缩宫素与不同位置的受体结合,故而不同的针刺条件下也可能诱发不同的调节途径，导致OTR mRNA相对表达量表现不同[18],从而出现本实验治疗组OTR mRNA的差异结果。

综上所述，分析认为不同刺激量下针刺关元穴对寒凝类痛经模型大鼠的效应有所不同，粗针、深刺、行手法的疗效较细针、浅刺、不行手法的针刺效应佳，提示针刺的刺激量也是决定针刺疗效的因素之一。

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Different acupuncture stimulus at“Guanyuan(RN4)”on dysmenorrheal rats model with cold syndrome

CUI Xiao1,ZHOU Jin1,ZHANG Mei1,LIU Zhenzhen1,YANG Jiamin1,QI Dandan1,GUO Mengwei1,2,ZHAO Yafang1,2,LI Xiaohong1,REN Xiaoxuan1,2,ZHANG Lufen1,2*

(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Acupuncture Biology Ⅲ Laboratory of State Administration of TCM,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the analgesia mechanism of different acupuncture stimulus at “Guanyuan(RN4)” on dysmenorrheal rats model with cold syndrome by observing the concnet of contraction receptor (OTR) and myosin light streptokinase (MLCK) of uterine tissue in rats.MethodsThe 32 female SD rats at diestrus with 3 months aged were randomized into 4 groups,including a saline control group，a cold stagnation of dysmenorrheal model control group,an A stimuli group and a B stimuli group,with 8 rats in each group.Except the saline control group rats given intraperitoneal injection 0.9% Nacl,in the rest groups rats were treated with the whole body freezing method combined with estradiol benzoate injection mold.ResultsExcept the saline control group and model control group,the acupuncture groups acupunctured the RN4 point for 20 min after modeling,the A stimuli group needled acupoint with thick needle and insert deeper with manipulation;the B stimuli group with fine needle and insert shallowly without manipulation.Observe the OTR by Polymerase Chain Reaction (PCR) and MLCK by ELISA in uterine of 8 rats in each group.ConclusionDifferent acupuncture stimulus at RN4 on experimental cold syndrome of dysmenorrheal model rats have different effect,inserting deeper with thick needle and exerting manipulation is better than fine needle and inserting shallowly without manipulation.It indicate that different acupuncture stimulus is one of the vital factors to determine the acupuncture therapeutic efficacy.

Keywords：acupuncture therapy;point,Guanyuan,RN4;dysmenorrheal with cold syndrome;OTR;MLCK

(收稿日期:2015-10-09)

文章编号：2095-6258(2016)02-0241-04

中图分类号：R246.2

文献标志码：A

*通信作者：张露芬，电话-13641280192，电子信箱-zhlufen@aliyun.com

作者简介：崔晓(1989-)，女，硕士研究生，主要从事针灸的神经生物学机制研究。

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2012CB518506)；国家中医药管理局针灸特色疗法评价重点研究室。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.007