城市森林不同林型下土壤基本理化特性及土壤真菌多样性1)

高微微　康颖　卢宏　王秋玉

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



城市森林不同林型下土壤基本理化特性及土壤真菌多样性1)

高微微康颖卢宏王秋玉

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

摘要以东北林业大学哈尔滨城市林业示范基地8种人工纯林(胡桃楸、水曲柳、黄檗、白桦、兴安落叶松、樟子松、黑皮油松、红皮云杉)为研究对象，在对不同纯林的土壤酸碱度、相对含水量和电导率等基本理化性质检测的基础上，进行了各样品的土壤真菌宏基因组间差异研究，结果显示：不同人工纯林的土壤酸碱度、相对含水量和电导率都存在着显著的差异，pH值的变化范围在4.597～7.393，相对含水量为4.11%～10.90%，土壤电导率为953.000～3 443.333 μs·cm(-1)，其中胡桃楸林的土壤pH值和电导率最高，兴安落叶松林相反。土壤真菌宏基因组检测发现9个样品土壤真菌宏基因组间存在明显的差异，9个样品中共检测到8个真菌门、24个纲、63个目、124个科、211个属、362个种。其中真菌门和真菌纲水平的变化最明显，主要涵盖了子囊菌门、担子菌门、壶菌门、接合菌门、球囊菌门。另外，在黑皮油松中检测到近年来新发现的子囊菌门古菌根菌纲真菌，在对照样品中检测到担子菌门柄锈菌亚门伞型束梗孢菌纲真菌，在胡桃楸和水曲柳样品中检测到球囊菌门真菌，而担子菌门黑粉菌亚门外担菌纲真菌仅在对照和红皮云杉样品中检测到。在真菌门分类水平上，胡桃楸、水曲柳、兴安落叶松、樟子松样品中以子囊菌门真菌为优势菌种；白桦、黑皮油松、红皮云杉样品以担子菌门真菌为优势菌种。在真菌纲分类水平上，主要以伞菌纲真菌为优势菌种。水曲柳土样样品中发现优势菌种为子囊菌门盘菌亚门下的粪壳菌纲真菌。

关键词人工纯林；土壤基本理化性质；ITS序列；高通量测序

分类号S714.3

Basic Soil Physicochemical Properties and Soil Fungal Diversity under Different Forest Types of Urban Forest

Gao Weiwei, Kang Ying, Lu Hong, Wang Qiuyu

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：89-94，100.

We selected eight kinds of plantations from Urban Forestry Demonstration Base of Northeast Forestry University, includingJuglansmandshurica,Fraxinusmandshurica,Phellodendronamurense,Betulaplatyphylla,Larixgmelinii,Pinussylvestrisvar.mongolica,Pinustabulaeformisvar.mukdensis,Piceakoraiensis, and forest edge grassland as control to determine the main soil physicochemical properties including soil pH, relative water content and electrical conductivity, and detected the soil fungal metagenomics diversity. There were significant variation among different soil samples in three soil basic properties, such as 4.597-7.393 for pH value，4.11%-10.90% for relative water content, 953.000-3 443.333 μs·cm-1for soil electrical conductivity. The pH value and soil electrical conductivity were highest for soil ofJuglansmandshuricaplantation, and the lowest forLarixgmeliniiplantation. There were great difference in soil fungal metagenomics among eight soil samples. Total of 362 species, 211 genera, 124 families, 63 orders and 24 classes, 8 eumycota were in all soil samples. There were clear changes in the level of Eumycophyta and Eumycetes, including Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota, and Glomeromycota. An ancient mycorrhizal fungi of Ascomycota newly discovered in recent years was found in the forest soil ofPinustabulaeformisvar.Mukdensis, while Agaricostibomycete fungi of pucciniomycotina, Basidiomycota were detected in the control samples and Glomeromycota fungi in the forest soil ofJuglansmandshuricaandFraxinusmandshurica, Exobasidiomycete fungi of Ustilaginomycotina Basidiomycota were only detected in the forest soil ofPiceakoraiensisand control. The dominant species were the fungi of Ascomycota phylum in the forest soil ofJuglansmandshurica,Fraxinusmandshurica,Larixgmelinii,Pinussylvestrisvar.mongolica, and Basidiomycota fungi in the forest soil ofBetulaplatyphylla,Pinustabulaeformisvar.Mukdensis,Piceakoraiensisin Eumycophyta level. The dominate species in Eumycetes level were mainly Agaricomycetes fungi, in which sordariomycetes fungi of Pezizomycotina, Ascomycota as the dominate species were only found in the soil sample ofFraxinusmandshurica.

KeywordsPure plantation; Soil physicochemical properties; ITS sequence; High-throughput sequencing

城市林业土壤是城市林业生态系统的重要组成部分，是有效的城市环境净化器，它在实现城市林业三大效益的过程中发挥着重要作用。城市林业土壤属于人为新成土[1]，受人为干扰严重，其物理、化学性质以及生物学特性与自然土壤截然不同。与森林土壤一样，城市林业土壤的主要功能也是为林木的生长提供养分。土壤是林木生长赖以生存的直接载体，土壤质量的好坏直接影响林木的生长和生态景观的效果[2]。土壤的质地、相对含水量、酸碱度等都与林木的生长状况密不可分[3]。土壤质量是土壤维持林地生产力的保障，是衡量森林生产力的重要指标[4-5]。而土壤微生物是林业土壤生态系统中的重要功能群体，它们通过分解动物和植物残体为土壤生态系统提供养分[6-9]，参与森林生态系统的物质循环和能量流动。土壤微生物的群落结构、生物量、生物多样性等指标能够将土壤质量状况如实地反映出来。通过监测土壤微生物的丰度，就能表征城市林业的健康程度。目前，高通量测序技术在土壤微生物的研究中被广泛使用，Roesch et al.[10]采用454测序技术平台对土壤微生物的多样性进行分析，结果显示，森林土壤的微生物多样性比农田土更丰富。Campbell et al.[11]研究显示,北极冻土经长期施肥土壤微生物的丰度并未得到提高。Dos Santos et al.[12]采用高通量测序技术检测了石油污染的红树林土壤沉淀物中微生物多样性，发现微生物丰度相比未受到污染的沉积物显著降低。此技术为研究土壤微生物的丰度和分布奠定了很好的技术基础。

本研究以黑龙江省哈尔滨市东北林业大学哈尔滨城市林业示范基地种植的8种人工纯林为研究对象，在其土壤基本理化性质检测的基础上[13]，对各林型土壤真菌进行宏基因组高通量测序和统计分析。为今后城市林木的种植和管理提供有用的信息。

1研究地概况

东北林业大学哈尔滨城市林业示范基地位于黑龙江省南部的哈尔滨市中心(44°04′～46°40′N，125°42′～130°10′E)，位置在市区的松花江三级阶地的第二阶地上，地势有些起伏，海拔136～140 m，区域面积48.83 hm2，土壤的类型为黑土[14]，土地肥沃。

东北林业大学哈尔滨城市林业示范基地种植了东北林区十几个主要造林树种，包括胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim.)、水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr.)、黄檗(PhellodendronamurenseRupr.)、白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)、兴安落叶松(Larixgmelinii(Rupr.) Kuzen.)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.)、黑皮油松(Pinustabulaeformisvar.mukdensis)和红皮云杉(PiceakoraiensisNakai)等，每个样地面积为0.5 hm2,现林龄均为50～60 a，平均树高为20.6 m，平均胸径为32.1 cm，林分密度为720～1 470株·hm-2，活立木蓄积量为94.1～158.4 m3·hm-2[15]。目前，林地常规的管护经营良好，林木生长茂盛，已具备森林景观特征。

2研究方法

土样采集：在东北林业大学哈尔滨城市林业示范基地选取了8块人工纯林样地，即胡桃楸、水曲柳、黄檗、白桦、兴安落叶松、樟子松、黑皮油松、红皮云杉。每块样地随机设置3个5 m×5 m样方，每个样方按对角线法取5个样点，采集0～20 cm土层的土样。样方内5个样点的土壤均匀混合，共得到3个平行样，过2 mm筛。将样品带回实验室后，进行风干处理，用于土壤pH值和土壤电导率的测定，在4 ℃下保存土样用于相对含水量的测定及ITS序列分析。采集林间空地土样为对照(CK)，重复3次。土壤编号为JM(胡桃楸)、FM(水曲柳)、PA(黄檗)、BP(白桦)、LG(兴安落叶松)、PS(樟子松)、PT(黑皮油松)、PK(红皮云杉)。

土壤相对含水量、pH值、电导率的测定：土壤相对含水量的测定采用称质量法，pH值采用电位法来测定，电导率采用土壤溶液电导法测定[16]。

真菌ITS序列高通量测序：本研究使用OMEGA的E.Z.N.A. Soil DNA Kit(北京全式金生物技术有限公司产品)提取土壤真菌总DNA，然后进行土壤真菌总DNA-ITS序列的PCR检测。ITS序列引物为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；PCR反应程序为热启动，预变性94 ℃ 2 min；变性94 ℃ 30 s，退火59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，35个循环；延伸72 ℃ 7 min；4 ℃保存。高通量测序送到上海美吉生物公司完成(Roche 454 GS FLX+,USA),最后进行生物信息分析，即数据优化与统计，为了改善测序数据的质量和消除测序随机错误的影响，将从文库中删除一些有缺陷的数据；OTU聚类分析，读取小于150 bp的有6个以上重复单碱基、完整条码和引物的序列为有效阅读序列，将测序的序列聚成操作分类单元(OTU)，然后利用Mothur程序(http://www.mothur.org/wiki/main_page)和社区0.03个序列之间的距离来进行OTU聚类分析[17]；多样性指数(Alpha-diversity)分析，基于OTU基础上进行Ace(用来估计群落中含有OTU数目的指数)、Chao(使用chao1算法估计群落中含OTU数目的指数，chao1算法在生态学中常用来估计物种总数)、Simpson(用来估算样品中微生物的多样性指数，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性)和Shannon(用来估算样品中微生物的多样性指数)分析，群落Heatmap图由R包生成[18]。

数据分析：采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和分析；用SPSS 19．0对数据进行单因素方差分析和双因素方差分析，评价差异显著性。

3结果与分析

3.1不同树种纯林的土壤酸碱度、相对含水量和电导率

研究发现，不同人工纯林的土壤酸碱度、相对含水量和电导率都存在着显著的差异(表1)。供试人工林土壤pH值为4.597～7.393，土壤酸碱度由大到小依次为对照、胡桃楸、水曲柳、红皮云杉、黄檗、樟子松、黑皮油松、白桦、兴安落叶松。除对照土和胡桃楸林下土为碱性土、水曲柳林为中性土外，其他林下土壤均呈现酸性。方差分析显示，8种人工林土壤pH值差异极显著，F=4 961.16***(P<0.001)。

表1　土壤基本理化性质

注:表中数据为平均值±标准差。

供试土壤的相对含水量均不是很高，但其中对照土壤和红皮云杉的土壤相对含水量相对较高，相对含水量达到10.30%～10.90%；而其他人工林的土壤相对含水量较低，相对含水量为4.11%～5.50%。方差分析表明，不同人工林间土壤相对含水量差异显著，F=339.08***(P<0.001)，人工林土壤相对含水量的显著差异可能与人工林树种的生长与形态差异有直接关系。

对供试土壤电导率的方差分析显示，不同人工林土壤电导率差异显著，F=31 033.98***(P<0.001)。其中白桦林的电导率最低，比对照土壤的电导率还低，为953.000 μs·cm-1；胡桃楸的电导率最高，为3 443.333 μs·cm-1。相关研究[19]表明，土壤电导率与土壤相对含水量存在一定相关性，随着土壤相对含水量增加，土壤电导率会随之减小。但是本研究结果并未表现这种趋势。不同人工林的土壤电导率的显著差异可能是由于林分不同导致的，土壤电导率与土壤相对含水量、酸碱度、地上植被等因素存在着复杂的相关性。

3.2土壤真菌ITS序列高通量测序

3.2.1DNA样品提取与检测

使用OMEGA的E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取土壤真菌总DNA，所有的目的条带都在23 kbp以上。由图1可见,DNA产物多糖除的较干净，无RNA干扰，DNA样品浓度高。DNA条带存在弥散现象且部分点样孔较亮，表明DNA样品存在断裂现象，有部分残留的蛋白，但由于主条带清晰，并不影响后续试验。

采用真菌ITS1-ITS4通用引物对真菌总DNA进行ITS-PCR检测，PCR检测结果可以看到目的序列在500～750 bp，表明PCR得到相应的目的序列。由图1可见,目的条带清晰，存在非特异性条带都大于750 bp，并非ITS-PCR的目的条带，故不影响后续试验。

A．抽提总DNA电泳检测结果；B.ITS1-ITS4引物PCR检测结果;M.Marker;CK.空白对照;1～9.依次代表CK、JM、FM、PA、BP、LG、PS、PT、PK。

3.2.2数据优化统计结果

土壤样品的ITS-PCR产物的宏基因组测序结果(表2)显示,获得的样品总碱基对共有130 451 125 bp，优化序列484 669条，序列平均碱基长度269 bp。优化序列长度主要分布在201～300 bp，还有少数分布在301～400 bp。从样品序列统计表中可以看出每个样品的碱基对在11 550 589 bp以上，优化序列均超过41 211条。

表2　样品序列统计

3.2.3群落结构组分分析

9个样品中共检测到24种真菌纲(表3)，包括子囊菌门盘菌亚门下的Dothideomycetes(座囊菌纲)、Eurotiomycetes(散囊菌纲)、Lecanoromycetes(茶渍纲)、Leotiomycetes(锤舌菌纲)、Orbiliomycetes(圆盘菌纲)、Pezizomycetes(盘菌纲)、Sordariomycetes(粪壳菌纲)，子囊菌门酵母菌亚门Saccharomycetes(酵母菌纲)，Ascomycota_norank(未命名子囊菌亚门)，子囊菌门新发现Archaeorhizomycetes(古菌根菌纲)；担子菌门下的Tremellomycetes(银耳纲)、Ustilaginomycetes(黑粉菌纲)、Agaricomycetes(伞菌纲)、Wallemiomycetes(节担菌纲)，担子菌门柄锈菌亚门下的Agaricostilbomycetes(伞型束梗孢菌纲)、Microbotryomycetes(微球黑粉菌纲)，担子菌门黑粉菌亚门下的Exobasidiomycetes(外担菌纲)，Basidiomycota_norank(未命名担子菌门)；芽枝霉门下的Blastocladiomycetes(芽枝霉纲)；鞭毛菌亚门下的Chytridiomycetes(壶菌纲)；Unclassified(未分类真菌)、Unidentified(未鉴定真菌)、Fungi_norank(未命名真菌)、Incertae(未定目科真菌)。

表3　真菌各纲相对丰度　%

在真菌纲分类水平上，9个样品中仅水曲柳样品的优势菌落是子囊菌门盘菌亚门下的粪壳菌纲真菌，其余样品优势菌落均为担子菌门的伞菌纲真菌，对照和胡桃楸样品中的优势菌落则为未分类真菌。样品中微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。各样品中优势菌落真菌相对丰度依次为对照55.53%、胡桃楸31.98%、水曲柳27.16%、黄菠萝68.55%、白桦65.23%、兴安落叶松33.51%、樟子松21.52%、黑皮油松43.28%、红皮云杉33.65%。子囊菌门新发现的古菌根菌纲真菌仅在黑皮油松中检测到，担子菌门柄锈菌亚门伞型束梗孢菌纲真菌仅在对照组中检测到，而担子菌门黑粉菌亚门外担菌纲真菌仅在对照和红皮云杉样品中发现。

3.2.4Heatmap热图分析

通过Heatmap将9个样品土壤真菌的Ascomycota子囊菌门、Basidiomycota担子菌门、Chytridiomycota壶菌门、Zygomycota接合菌门、Norank未命名真菌、Unclassified未分类真菌相对丰度按照不同颜色变化显现出来。根据9个样品的真菌相对丰度特征，按照真菌相似度进行聚类，兴安落叶松与黑皮油松土壤真菌相似度最高先聚为第一类；黄檗与白桦土壤真菌相似度最接近聚为第二类；胡桃楸和水曲柳先聚在一起，再与樟子松、红皮云杉聚为第三类；对照单独为一类(图2)。

通过图2可知，子囊菌门真菌相对丰度在胡桃楸土壤样品中最高，其次是樟子松、红皮云杉、黑皮油松，对照最低。担子菌门真菌相对丰度是樟子松最高，黑皮油松、胡桃楸次之，红皮云杉相对丰度最低。壶菌门真菌相对丰度是兴安落叶松最高，红皮云杉最低。接合菌门红皮云杉最高，水曲柳、樟子松次之，胡桃楸最低。由此可见，不同林型下土壤真菌的相对丰度和分布存在很大差异。

图2　真菌各门相对丰度热图

3.2.5OTU聚类与多样性

试验结果共得到2 387种真菌在种水平上的分类单元(OTU)，指数评估的OTU相似度水平为97%。使用Ace和Chao指数来评估菌群丰度，结果见表4，由表4可知，同一样品的Ace与Chao指数大小差别不大，9个样品中Ace指数显示的物种丰度由大到小的顺序是水曲柳、胡桃楸、兴安落叶松、樟子松、红皮云杉、黄檗、白桦、黑皮油松、对照。Chao显示的物种丰度由大到小的顺序为水曲柳、兴安落叶松、胡桃楸、樟子松、红皮云杉、黄檗、黑皮油松、白桦、对照。已知Shannon指数越大群落多样性越高，Simpson指数反之。9个样品中Shannon指数表征的群落多样性由大到小表现为樟子松、胡桃楸、水曲柳、黑皮油松、白桦、红皮云杉、兴安落叶松、对照、黄檗。Simpson指数的群落多样性由大到小表现为樟子松、水曲柳、胡桃楸、黑皮油松、红皮云杉、白桦、兴安落叶松、对照、黄檗。单因素方差分析结果显示，不同人工林土壤真菌丰度差异显著，Ace与Chao指数的F值分别为9.353**、6.785**(P<0.05)。不同人工林土壤真菌群落多样性差异极显著，Shannon和Simpson指数的F值分别为2 087.421***、2 443.562***(P<0.001)。

表4　OTU聚类与多样性分析

3.3土壤基本理化性质对土壤真菌多样性的影响

经Pearson相关性分析可知(表5)，担子菌门真菌相对丰度与土壤酸碱度呈显著负相关，F=-0.727*，说明pH值低的土壤担子菌相对丰度高；球囊菌门真菌相对丰度与土壤电导率呈极显著正相关，F=0.866**，即土壤球囊菌相对丰度会随着土壤浸出液电导率升高而增高；未能分类真菌相对丰度与土壤酸碱度、土壤相对含水量呈显著正相关，F值分别为0.698*，0.796*。未能命名真菌相对丰度与土壤电导率呈显著正相关，F=0.674*。

表5真菌门相对丰度与土壤pH值、相对含水量以及电导率之间的Pearson相关性

相关因子pH值WcEc子囊菌门相对丰度-0.105-0.0620.339 担子菌门相对丰度-0.727*-0.494-0.395壶菌门相对丰度-0.276-0.2910.060球囊菌门相对丰度0.548-0.1560.866**接合菌门相对丰度0.004-0.0840.341未能分类真菌相对丰度0.698*0.796*-0.058未能鉴定真菌相对丰度0.1070.653-0.248未能命名真菌相对丰度0.497-0.2290.674*

注：*表示在0.05水平上达到显著水平；** 表示在0.01水平上达到极显著水平；WC.土壤相对含水量;EC.土壤电导率。

4结论与讨论

土壤相对含水量、酸碱性、电导率均属于土壤基本属性，直接显示出植被的生长环境，间接反映出土壤肥力和植物的生长状况。本研究结果显示，土壤相对含水量、pH值、电导率存在极显著差异，且阔叶林间、针叶林间也存在极显著差异，这种差异性可能是由人工林树种组成差异导致的。人工林树种组成不同，其树木长势、郁闭度、凋落物覆盖厚度、根系分泌物等因素也会有所不同，导致了人工林土壤基本特征、土壤肥力的差异性。而且在研究中发现，人工林间土壤真菌数量存在显著差异，这种差异性可能与人工林树种组成差异有关。土壤微生物对环境变化十分敏感，细微的环境变化都会使得土壤微生物数量、群落结构发生改变，样品间土壤微生物数量的差异，暗示了样地的土壤生态环境存在较大差异，这种差异与土壤理化性质、林分类型有着密切的关系。

余雷等[20]研究表明，森林土壤相对含水量与林分郁闭度、凋落物覆盖厚度有关。红皮云杉的土壤相对含水量较高，可能由于该林的郁闭度较高，红皮云杉因长势较好，林木茂盛，林木较密，林下不适合市民晨练，因此，受人为干扰较小，使得土壤较湿润，土壤相对含水量就比较高。胡桃楸和水曲柳林相对含水量较高则可能是由于落叶覆盖率较其他人工林高。而黑皮油松林的郁闭度虽然较大，但林下植被几乎没有，又由于黑皮油松长得比较高，林下比较宽敞，所以常被市民用于晨练活动场所，因此，其林下土壤相对含水量就较低。白桦林由于长势不是很好，郁闭度较差，土壤蓄水能力较差，因此，白桦林的土壤相对含水量是最低的。

通过Ace和Chao指数评估土壤真菌菌群丰度，结果显示，水曲柳土壤真菌群落丰度最大，对照的最小，白桦或黑皮油松次之。通过Shannon和Simpson指数评估了土壤真菌菌群多样性，结果显示樟子松林土壤真菌的群落多样性最大，黄檗群落多样性最小，对照次之。由此可见，采用不同指数评价人工林土壤真菌群落多样性和群落丰度在一些林型中是一致的，如胡桃楸和水曲柳，但在另一些林型中是存在差异的，如樟子松和黄檗林，其原因有待于进一步探讨。

从真菌门分类水平上看，胡桃楸、水曲柳、兴安落叶松、樟子松林土样中以子囊菌门真菌为优势菌落，黄檗、白桦、黑皮油松、红皮云杉林土壤样品以担子菌门真菌为优势菌落。另外，只在胡桃楸和水曲柳林样品中检测到球囊菌门真菌，仅在红皮云杉样品中发现未能鉴定真菌。以真菌门为分类水平的真菌相对丰度与土壤基本理化性质、土壤微生物数量等土壤肥力指标在一些林型中存在显著相关性。

在真菌纲分类水平上，样品主要以伞菌纲真菌为优势菌落，仅水曲柳林样品优势菌落为子囊菌门盘菌亚门下的粪壳菌纲真菌。另外，仅在黑皮油松中检测到新发现的子囊菌门古菌根菌纲真菌，在对照样品中检测到担子菌门柄锈菌亚门伞型束梗孢菌纲真菌，而担子菌门黑粉菌亚门外担菌纲真菌仅在红皮云杉林样品中检测到。由此可见，同样立地条件下，由于地上植被的不同会带来林下土壤基本理化性质和土壤真菌微生物的明显差异。

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收稿日期：2015年9月11日。

第一作者简介：高微微，女，1989年6月生，东北林业大学生命科学学院，硕士研究生。E-mail:SWGWW18714445113@163.com。通信作者：王秋玉，东北林业大学生命科学学院，教授。E-mail:wqyll@sina.com。

1)国家林业局“948”项目(2008-4-34)。

责任编辑：任俐。