强骨宝对去势大鼠原发性膝骨关节炎关节软骨影响的实验研究

王文胜 陈伟 沈保磊 许波 张俐

【摘 要】目的：建立去势后原发性膝骨关节炎大鼠模型，观察强骨宝对模型鼠关节软骨形态学及软骨基质的影响，为进一步研究提供基础。方法：①去势后原发性膝骨关节炎模型建立：麻醉下摘除双侧卵巢1周后行疲劳性跑步训练，跑台坡度-15°，频率28 m·min-1，60 min·d-1，每周6 d，建立膝骨关节炎模型。分别于2，4，6周后检测尿液中Ⅱ型胶原羧基端肽（CTX-Ⅱ），制作股骨髁病理切片鉴定模型。②动物分组与给药：将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、强骨宝组、阳性对照组，分别给予相应处理。③取材与检测：给药4周后，取尿液、血清、双侧股骨髁，检测尿液中CTX-Ⅱ含量，股骨髁软骨经HE染色处理后行Mankin评分。结果：①模型鉴定：根据尿液CTX-Ⅱ含量及软骨Mankin评分结果，造模

4周后关节软骨开始退变，6周后退变明显，模型成功。②给药治疗：Mankin评分及CTX-Ⅱ含量测定结果，与空白对照组比较，模型对照组、强骨宝组、阳性对照组均增高（P < 0.01或P < 0.05）；与模型对照组比较，强骨宝组、阳性对照组均降低（P < 0.05）；与阳性对照组比较，强骨宝组差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：强骨宝可减缓原发性膝骨关节炎模型鼠的软骨损伤进程。

【关键词】 骨关节炎，膝；强骨宝；动物模型；大鼠；实验研究

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.04.002

Experimental Study on the Effect of Qianggu Bao （强骨宝） on the Articular Cartilage of Primary Knee Osteoarthritis in Ovariectomized Rats

WANG Wen-sheng，CHEN Wei，SHEN Bao-lei，XU Bo，ZHANG Li

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Qianggu Bao（强骨宝）on the articular cartilage of primary

knee osteoarthritis in ovariectomized rats.Methods：①Establishing models of ovariectomized rats with primary knee osteoarthritis：After anesthesia，bilateral ovariectomy was performed for the experimental rats.After one week，they were forced to do fatigued running training on 15-degree treadmill with frequency of 28 m·min-1，60 min·d-1，for 6 days a week to establish knee osteoarthritis models.CTX-Ⅱin urine was detected respectively after 2，4 and 6 weeks，making pathological identification model of femoral condyle.②Grouping and administration：Successfully modeled rats were randomly divided into a model group，a Qianggu Bao group and a positive control group，and each group was given corresponding treatment.③Sanjmpling and detection：After 4 weeks of administration，urine，serum and bilateral femoral condyle were sampled to detect the content of CTX-Ⅱin urine and make Mankin scores to femoral condyle cartilage after HE staining.Results：①Model identification：According to the content of

CTX-Ⅱin urine and Mankin scores of femoral condyle cartilage，articular cartilage degeneration began after 4 weeks of modeling，which was obvious after 6 weeks，so the models were successfully established.

② Administration for treatment：Compared with the blank control group，Mankin score and CTX-Ⅱcontent of the model control group，the Qianggu Bao group and the positive control group all increased （P < 0.01 or P < 0.05）；compared with the model control group，those of the Qianggu Bao group and the positive control group decreased （P < 0.05）；and the difference between the positive control group and the Qianggu Bao group had no statistical significance （P > 0.05）.Conclusion：Qianggu Bao can slow down the process of cartilage damage in model rats with primary knee osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Qianggu Bao（强骨宝）；animal model；rats；experimental study

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）属于退行性病变，致残率高达53%，全国40岁以上人群患病率为46.3%，其中女性患病率为50.4%[1]。本病的病理改变以关节软骨损害为主，累及整个关节，出现关节及其周围软组织疼痛、肿胀、功能障碍、畸形等临床表现[2]，严重影响患者的身心健康。强骨宝是我国骨伤泰斗张安桢教授的经验方，由骨碎补、补骨脂、木瓜、当归、川芎、三七、甘草7味药组成，临床治疗骨关节疾病效果显著。本方药性以辛、温为主，辛以活血行气，温以祛寒除湿；归经以肝、脾、肾三经为主。骨碎补苦温入肾，入肾而治骨，补骨脂苦辛温燥，善壮肾阳，二药相须而用，为本方君药，共奏强筋壮骨之功。当归长于补血，兼散寒活血止痛；川芎为“血中之气药”，善活血行气，兼祛风通络止痛；三七专于活血化瘀止痛，兼补虚强壮之功；木瓜味酸入肝，温香入脾，舒筋活络化湿除痹之力俱强；此4味共为臣药，辅助君药补肝肾，强筋骨，并兼顾气虚血瘀、风寒湿阻等标证。甘草为佐使，调和诸药，防止温热太过而伤阴，减轻长期服用骨碎补产生的毒性，又可增强缓急止痛的功效。前期研究表明，强骨宝可降低模型鼠血清及关节软骨一氧化氮合成酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）含量，降低血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达，提高血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）表达[3]，本研究进一步观察强骨宝对关节软骨退变的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 6月龄SPF级SD大鼠，78只，雌性，体质量（360±20） g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证书号SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房，合格证号2009-0001。

1.2 实验药物 8万单位硫酸庆大霉素注射液（福州海生福王制药有限公司）；0.9%生理盐水（福州海生福王制药有限公司）；强骨宝颗粒剂（福建省中医药科技开发总公司）；筋骨痛消丸（河南省洛正制药厂，国药准字Z10970117）。

1.3 实验试剂和仪器 ZH-PT动物跑台（淮北正华生物仪器设备有限公司）； ELX800型全自动酶标仪（美国Biotek公司）；DMI 6000+型生物倒置显微镜（德国Leica仪器有限公司）；大鼠血清、尿液CTX-Ⅱ ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

2 方 法

2.1 造模方法 随机选取24只为空白对照组，

18只为去势组，36只为模型组。去势组仅摘除卵巢，模型组摘除卵巢并造模，造模方法参照文献[4]中去卵巢后联合疲劳损伤诱导法：麻醉下摘除双侧卵巢，1周后运用小动物跑步台行疲劳性跑步训练，跑台坡度-15°，频率28 m·min-1，60 min·d-1，每周6 d。

2.2 模型鉴定方法 分别于造模2，4，6周时，各组随机选取6只处死，鉴定模型，共用54只。取材：代谢笼收集24 h尿液后实施安乐死，取双侧股骨髁。经腹主动脉采集动脉血，静置1 h后离心机3000 r·min-1离心10 min，取上层血清，

-80 ℃冻存。检测：截取双侧膝关节，4%多聚甲醛固定48 h，股骨髁经10%EDTA脱钙6周，石蜡包埋，切片苏木素-伊红（HE）染色后对比形态学改变，记录Mankin评分；采用酶联免疫吸附双抗体夹心法，检测尿液中CTX-Ⅱ浓度。

2.3 分组方法 将造模成功后剩余的18只模型组大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、强骨宝组，每组6只，给予相应治疗。

2.4 给药方法 空白对照组予以常规饲养；模型对照组于造模成功后常规饲养；阳性对照组选用筋骨痛消丸灌胃，药物浓度为0.5 g·mL-1；强骨宝组给予强骨宝灌胃，药物浓度为0.7 g·mL-1。给药剂量均定为0.5 mL·（100 g）-1，每日2次，共给药4周。给药治疗4周后全部处死，取材，检测（方法同2.2中取材与检测），统计分析强骨宝作用。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料符合正态性分布以表示，各组间比较采用独立样本t检验，组内前后比较采用配对样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学

意义。

3 结 果

3.1 模型的鉴定 根据尿液CTX-Ⅱ含量及软骨Mankin评分结果，造模4周后关节软骨开始退变，6周后退变明显，模型成功。见表1、图1。

3.2 治疗后各组软骨CTX-Ⅱ和Mankin评分含量观察 与空白对照组比较，其余3组均显著增高

（P < 0.01或P < 0.05），与模型对照组比较，强骨宝组与阳性对照组均降低（P < 0.01），强骨宝组与阳性对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2、图2。

4 讨 论

中医学从整体观的角度认知KOA的发病与防治，本病之病变虽在关节局部筋骨，但究其病根在肝脾肾三脏虚衰；另外，工作生活带来的慢性损伤及风寒湿邪的入侵是发病的重要条件。《黄帝内经》有云：“肝主筋。”“肾主骨。”“脾主肌肉。”“风寒湿三气杂至合而为痹。”“女子七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通；男子七八肝气衰，筋不能动。”《景岳全书》云：“盖痹者闭也，以气血为邪所闭，不得通行而病也。”人到中年，尤其是女性，进入围绝经期后，正气日衰，肝脾肾渐亏，精气血瘀滞，复感外邪或外伤劳损，极易罹患本病，其病机特点可概括为“本虚标实，本痿标痹，痹痿并存”[5-6]。

《内经》有云：“上工治未病。”KOA属于慢性退行性疾病，早期治疗对减轻患者病痛，延缓疾病的发展进程均具有积极的意义。KOA发病初期以关节软骨变性损伤为主要病理改变，关节软骨属中医学“筋骨”范畴，CTX-Ⅱ是Ⅱ型胶原最主要的降解产物，属于非新合成产物，全部以小肽的形式经过血液循环进入尿液，与其他软骨代谢产物相比具有较长时间的稳定性和可靠性，可作为骨关节炎早期诊断的有效指标[7]。有学者研究表明，软骨潮线漂移是骨关节炎软骨退变进程中必经的病理变化[8]。

补肾祛瘀法是中国传统医学治疗骨关节炎的经典治法之一，可有效降低多种细胞因子水平，从而实现改善慢性滑膜炎症，控制或减轻关节软骨的损伤进程，减轻疼痛，增强肌肉耐力及关节活动能力等效果[9]。强骨宝是在补肾祛瘀的思路下组方，以补肾祛瘀药为君，此类中药是历代医家治疗KOA的方药中应用较多，研究较深入的一类[10]，整方立意攻补兼施，祛瘀而不伤正，补虚而不留邪，可获正盛而邪去，实现防治KOA的目的，这与娄多峰的“虚邪瘀”思想有异曲同工之妙[11]。本研究结果显示，与模型对照组比较，强骨宝组关节软骨Mankin评分及尿液CTX-Ⅱ浓度明显降低，与阳性对照组比较无明显差异，说明该方可降低大鼠早期膝关节软骨的损伤程度，可在KOA的预防与治疗中发挥积极作用，值得进一步研究运用。

5 参考文献

[1] 葛均波，徐永健，梅长林，等.内科学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2014：852-854.

[2] 中华中医药学会.骨性关节炎[J].风湿病与关节炎，2013，2（2）：71-73.

[3] 李芃，张俐.强骨宝对疲劳性损伤诱发膝骨关节炎模型大鼠的作用[J].风湿病与关节炎，2015，4（2）：30-33.

[4] 张俐，李芃，陈凯.去势大鼠劳损性膝骨关节炎新模型的建立[J].中国中医骨伤科杂志，2014，22（11）：1-3.

[5] 张俐.中医骨病学[M].北京：人民卫生出版社，2012：24-26.

[6] 庞坚，罗明江，曹月龙，等.刍论膝骨关节炎“本痿标痹，痹痿并存”[J].上海中医药杂志，2013，47（3）：25-26.

[7] 王学宗，高宁阳，刘婷，等.软骨标志物CTX-Ⅱ在骨关节炎中的应用[J].中国骨伤，2013，26（3）：260-263.

[8] 李西海，梁文娜，叶蕻芝，等.骨关节炎软骨潮线漂移与软骨退变的相关性研究[J].风湿病与关节炎，2014，4（1）：10-15.

[9] 肖志锋，阚卫兵，赵婧，等.补肾活血法对骨关节炎相关因子调控作用研究进展[J].环球中医药，2014，7（11）：883-888.

[10] 王文胜，张俐.补肾祛瘀类中药治疗中老年女性膝骨关节炎的研究概况[J].风湿病与关节炎，2015，4（3）：69-73.

[11] 李满意，娄玉钤.娄多峰教授治疗骨关节炎经验总

结[J].风湿病与关节炎，2015，4（7）：43-46.

收稿日期：2015-11-23；修回日期：2016-01-04