细粒棘球绦虫未知功能基因384p02i04的克隆及生物信息学分析

刘　辉， 肖云峰， 赵　军， 王建华， 吕国栋

(新疆医科大学第一附属医院1临床医学研究院， 新疆重大疾病医学重点实验室； 2药学部临床药研室， 乌鲁木齐　830054)



细粒棘球绦虫未知功能基因384p02i04的克隆及生物信息学分析

刘辉1， 肖云峰2， 赵军2， 王建华2， 吕国栋1

(新疆医科大学第一附属医院1临床医学研究院， 新疆重大疾病医学重点实验室；2药学部临床药研室， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的克隆细粒棘球绦虫与药物应激相关的未知功能基因384p02i04序列，并进行生物信息学分析。方法提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)法扩增384p02i04基因片段，测序，并进行生物信息学分析。采用定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)法分析青蒿素、阿苯达唑和吡喹酮等药物干预对384p02i04基因表达的影响。结果384p02i04基因全长449 bp，通过各种生物数据库对该基因进行预测，发现384p02i04基因存在1个编码109个氨基酸的蛋白质开放阅读框，利用BLAST数据库将其核酸及氨基酸序列进行比对，并未发现相似度较高的基因及氨基酸，利用RNA structure软件发现384p02i04基因具有非常低的自由能，其二级结构非常稳定。在青蒿素、阿苯达唑和吡喹酮等药物干预后384p02i04基因均明显下调(P<0.05)。结论克隆获得细粒棘球绦虫的一种与药物应激反应相关的未知功能基因，为研发以该基因为靶点的抗包虫病药物奠定基础。

关键词：细粒棘球绦虫； 药物应激； 基因克隆； 生物信息学分析

包虫病(echinococcosis)是一种严重的人畜共患寄生虫疾病，在我国主要为囊型包虫病(cystic echinococcosis，CE)，该病是由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus, Eg)的蚴虫寄生于中间宿主(羊、牛和人等)所致[1-3]。我国西部的新疆、青海、宁夏、甘肃、西藏、四川和内蒙古7个省区为包虫病的高流行区，包虫病尤其严重影响我国农牧民的健康生活，并造成严重经济损失，仅我国每年损失逾30亿元人民币。随着我国各地区间活牲畜和牲畜产品等的流通，该病已从牧业区扩散至农业区和城区，并从西部7个省区向我国其他地区传播[4-6]。近年来，国家加强了包虫病防治工作，制定下发了“2010-2015年《防治包虫病行动计划》”。但由于难于控制传染源，缺乏高效防控包虫病手段等问题，致使在包虫病防治工作中亟需研发新型抗包虫病药物和疫苗[7]。

本课题组前期利用基因芯片发现了1个未知功能基因384p02i04在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达，能被阿苯达唑(ABZ)和青蒿素(ART)等药物影响[8]，推测其有可能是一个重要的药物靶点。为进一步鉴定该基因的性质，本研究克隆了该基因序列，进行生物信息分析，并研究其表达与抗包虫药物干预之间的关系。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器ND-1000型微量紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)，低温高速离心机、real-time qRT-PCR仪CFX96TM(美国BIO-RAD公司)。胎牛血清(FBS)和RPMI 1640培养基(美国Gbico公司)，二甲基亚砜(DMSO)和甲醛(美国Sigma公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM荧光染料试剂盒(大连宝生物公司)，引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。

1.2原头蚴培养感染细粒棘球绦虫的羊肝采自新疆乌鲁木齐市华凌屠宰场，无菌采取囊液，自然沉淀，弃去上清，沉淀物用无菌PBS清洗3～5次，伊红染色计数，选择存活率>95%的原头蚴，采用89% RPMI 1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗的混合培养基培养，置于37℃、5% CO2恒温细胞培养箱中孵育。

1.3cDNA反转录合成采用Trizol RNA提取试剂盒提取，获得细粒棘球绦虫原头蚴的总RNA。并以该RNA为模板，采用PrimeScript RT反转录试剂盒合成cDNA。

1.4基因克隆基于384p02i04的EST序列设计其3′RACE和5′RACE引物(表1)，3′RACE和5′RACE实验方法参照 3′RACE和5′RACE 试剂盒说明书。根据RACE实验结果设计扩增引物，并PCR扩增，PCR产物连接至pMD18-T载体，经转化和EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定后，送北京六合华大基因科技有限公司测序。

表1　基因克隆和qRT-PCR实验引物

1.5生物信息学分析384p02i04基因的开放阅读框、RNA二级结构及稳定性分别通过DNAMAN软件和RNA structure软件分析，利用BLAST程序将384p02i04基因序列与GenBank数据库中的基因进行同源序列对比。启动子预测和外显子分析的网址分别为http://www.fruitfly.org/seq_tools /promoter.html和www.ncbi.nim.nih.gov/spidey。对于编码产物利用ExPASy(http://www.expasy.org/)的PROSITE工具进行蛋白质理化性质的预测。蛋白质的亚细胞定位采用PSORTⅡ(http://psort.hgc.jp/form2.html)预测。InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和NCBI Conserved Domains预测蛋白质的功能位点和结构，Motif Scan和ELM寻找蛋白质可能的功能基序，利用TMHMM站点了解该基因编码的蛋白质是否具有跨膜结构。Signal IP3.0服务器预测该蛋白是否具有信号肽的裂解位点。

1.6药物干预精密称取ABZ、ART、砒喹酮(PQZ)、双氢青蒿素(DHA)、蒿甲醚(AMT)和青蒿琥酯(AS)药物各2.00 mg，分别置于1.5 mL无菌EP管中，均加入0.2 mL DMSO涡旋溶解，制备获得药物母液。实验分组：空白对照组(只加入200 μL RPMI 1640培养液)、1% DMSO溶剂对照组(198 μL的RPMI 1640培养液和2 μL DMSO)和药物干预组(分别加198 μL的RPMI 1640培养液和2 μL各药物母液)，每组培养液与相应的溶液混匀后置37℃、5% CO2孵箱培养。各实验组均设3个复孔，每孔约200个原头蚴，实验周期为2 d，实验完成后取各组原头蚴，PBS清洗3次，吸取上清后置1.5 mL EP管液氮冻存，提取RNA并反转录成cDNA保存于-20℃。

1.7qRT-PCR选取细粒棘球绦虫原头节管家基因elp基因为内参基因，根据elp基因表达序列标签片段设计引物，384p02i04基因qRT-PCR引物与全长扩增引物相同(表1)。反应体系：SYBR MIX 10 μL、模版2 μL、上下游引物各0.5 μL，用无DNA酶H2O补齐至20 μL。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。

1.8统计学分析应用GraphPad Prism5.0统计分析软件，采用One-way ANOVA分析方法进行统计学分析。

2结果

2.1384p02i04基因克隆RT-PCR扩增出1条大约为250 bp的特异性片段(图1)，连接到pMD18-T载体后进行测序。

M： DL 2000 DNA分子量标志物； 1: 原头蚴RNA； 2： 阴性对照

图1384p02i04基因PCR扩增

2.2生物信息学分析DNAMAN5.0软件分析发现该基因有1个327 bp的开放阅读框，预测编码109个氨基酸的蛋白质，序列中含有亮氨酸最多有13个(11.9%)，赖氨酸最少，只有1个(0.9%)，包括6个强碱性氨基酸(K,R)、10个强酸性氨基酸(D,E)、41个疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V)和33个极性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)，预测分子量为12 596.64 ku，等电点为4.85。BLAST程序分析，未发现其他物种中有与该基因同源的基因。启动子预测发现,该基因起始密码子上游3 516～3 566 bp的DNA序列为启动子序列(TGACCTAATTTATAAAAGTGCGATCACTCTTACTAAAAA-

TCTTTTTATAA)。内含子分析结果表明，该基因并无内含子，说明该基因是由1个外显子构成。RNA structure软件分析结果显示，该基因具有稳定的RNA二级结构，其折叠自由能为-116.1 kcal/mol。利用SOSUI和TMHMM预测蛋白质跨膜区结果提示，该蛋白不存在跨膜区，并预测其可能为可溶性蛋白。通过PROSITE蛋白质数据库对该基因编码的蛋白序列中可能存在的隐含功能位点进行预测，其结果为没有任何位点存在于该基因，在64～66氨基酸处只有1个相似的磷酸化位点。PSORIⅡ预测最可能存在于细胞质中，该氨基酸序列区域的疏水性均在0以下，表明该蛋白是一个亲水性蛋白。信号肽预测结果表明，该基因没有信号肽存在。

2.3青蒿素等药物对384p02i04基因表达的影响384p02i04基因在相同时间相同剂量下在不同药物组干预原头节后表达均下调，和对照及溶剂组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，其中青蒿素组该基因下调最明显(图2)。

Y: 未干预组； DMSO：溶剂组； ABZ： 阿苯达唑； PQZ： 砒喹酮； ART： 青蒿素； DHA：双氢青蒿素； AMT： 蒿甲醚； AS： 青蒿琥酯

图2药物干预原头蚴对384p02i04基因表达量的影响

3讨论

细粒棘球绦虫基因组测序工作完成，为细粒棘球绦虫功能基因研究发现打下了坚实的基础[9-11]。目前有11 325条蛋白编码基因被预测，但其中含有大量的未知功能基因，而这些基因可能和细粒棘球绦虫生存、发育等过程息息相关。本课题组前期利用细粒棘球绦虫功能基因组芯片发现了1个未知功能基因384p02i04在被青蒿素和阿苯达唑等药物干预的细粒棘球绦虫原头蚴低表达，推测与该寄生虫的药物应激反应相关。本研究通过3’RACE、5’RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因全长序列。该基因全长为327 bp，在GenBank数据库中未发现其同源基因，是一个未知功能基因。

生物信息学分析推测，该基因具有稳定的RNA二级结构，其编码蛋白表达产物为亲水性蛋白，其64～66位氨基酸具有磷酸化位点，并定位于胞浆中，提示该蛋白可能参与信号传递。

为了进一步分析该基因与细粒棘球绦虫药物应激反应之间的关系，本研究分别选择了具有抗包虫活性的ABZ、ART、砒喹酮(PQZ)、双氢青蒿素(DHA)、蒿甲醚(AMT)和青蒿琥酯(AS)等药物[12-13]，体外干预细粒棘球绦虫原头蚴，发现这些药物均能影响该基因的表达，提示该基因是一个重要的治疗包虫病的药物靶点。

综上所述，本研究克隆获得1个与细粒棘球绦虫药物应激反应相关的未知功能基因384p02i04，完成了该基因的生物信息学分析和基因表达与药物干预之间关系的研究工作，为进一步以该基因为靶点，开展蛋白表达鉴定、酵母双杂交和RNAi干扰等性质和功能研究奠定了基础。

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(本文编辑杨晨晨)

Molecular cloning and bioinformatics analysis of a novel gene384p02i04 in Echinococcus granulosus

LIU Hui1, XIAO Yunfeng2, ZHAO Jun2, WANG Jianhua2, LV Guodong1

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,StateKeyLaboratoryIncubationBaseofXinjiangMajorDiseasesResearch，2DepartmentofPharmacy,ClinicalMedicineResearchLab,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract：ObjectiveTo do the clone and bioinformatics analysis of a novel drug stress-related gene in Echinococcus granulosus. MethodsThe gene sequence of 384p02i04 was cloned by RT-PCR and RACE methods from protoscolex of E. Granulosus and analyzed by bioinformatics. The gene expressions of 384p02i04 in the protoscoleces of E.Granulosus treated by artemisinin, albendazole and praziquantel were detected by qPCR. ResultsThe size of 384p02i04 gene was 449 bp and there was a protein with open reading frame encoded by 109 amino acids. The comparison with the data in BLAST database showed that the gene had low similarity to the known gene. The results in RNA structure analysis showed that the free energy of the gene was very low, and its secondary structure was very stable. Artemisinin, albendazole and praziquantel could down-regulate the gene expressions of 384p02i04 significantly (P<0.001). ConclusionA novel drug stress-related gene 384p02i04 in E. Granulosus was cloned successfully and laid a foundation for the development of anti-echinococcosis drug.

Key words:Echinococcus granulosus; drug stress; gene clone; bioinformatics analysis

[收稿日期：2015-12-11]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.04.010

中图分类号：R532.32

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)04-0426-04

作者简介：刘辉(1985-)，女，实验师，研究方向：新药研发，基础病理。通信作者：吕国栋，男，博士，副研究员，研究方向：分子生物学与基因芯片研究，E-mail：lgd_xju@163.com。

基金项目：国家自然科学基金( U1303222、81360251)；新疆重大疾病医学重点实验室开放课题资助项目(SKLIB-XJMDR-2012-2)