大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞的变化

向玉勇， 张云， 殷培峰， 朱萍

(滁州学院生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000)



大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞的变化

向玉勇*， 张云， 殷培峰， 朱萍

(滁州学院生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000)

摘要为了探讨金银花尺蠖(Heterolocha jinyinhuaphaga Chu)幼虫血细胞的免疫反应，该研究观察了经不同浓度大肠埃希菌(1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108个/mL)感染后不同时间(3、6、12和24 h)金银花尺蠖幼虫血细胞形态、总数及各类血细胞比例的变化。结果表明：感染各浓度大肠埃希菌菌悬液后，金银花尺蠖部分血细胞发生变形、破裂、核移位以及胞质出现空泡等变化；在感染后各时间段内，血细胞总数较对照组均有显著增加，且随着时间延长血细胞总数增加迅速，12 h时达最高水平，24 h之后开始下降；3 h时原血细胞的比例明显减少，随着时间的延长，比例不断下降，12 h时降至最低水平，24 h之后开始回升；而浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞的数量相对增加，12 h时升至最高水平，24 h之后开始下降，浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞在各时间段的比例差异有统计学意义(P<0.05)，而珠血细胞和类绛血细胞差异无统计学意义(P>0.05)。

关键词金银花尺蠖； 大肠埃希菌； 血细胞； 免疫反应

Variation of hemocytes of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu larva infected by Escherichia coli.JournalofZhejiangUniversity(Agric. &LifeSci.), 2016,42(2):163-168

XIANG Yuyong*, ZHANG Yun, YIN Peifeng, ZHU Ping (SchoolofBiologyandFoodEngineering,ChuzhouUniversity,Chuzhou239000,Anhui,China)

Summary Hemocytes are the main executor of cellular immune system, which play an important role in defense against pathogen invasion. The immune defense mechanism has been concerned by many scholars. Many studies showed that hemocytes would contact pathogen through hemolymph circulation when encounter with invasion of pathogen, and pathogen would be devoured, formed nodules and agglutinated into tumor or be coated. However, in the immune response, pathogens would produce toxins to cause damage, resulting in variation on morphology, quantity and proportion of the hemocytes. Therefore, studying the immune function and mechanism of the hemocytes will provide theoretical reference for biological control of the pests.

HeterolochajinyinhuaphagaChu was a newly discovered defoliator of honeysuckle, which was observed three generations per year in Anhui Province recently. The pest caused production reduction and even death of honeysuckle in a large scale, and brought great economic losses. Several studies have investigated the biological characteristics of the pest and its control measures, the immunity response of hemocytes has not been reported yet. In the preliminary study, six types of hemocytes including prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, spherulocytes, oenocytoids and cystocytes were found inH.jinyinhuaphagaChu larva. In this study, the hemocytes ofH.jinyinhuaphagaChu infected byEscherichiacoliwere investigated, and the variation of morphology, total number and proportion of hemocytes inH.jinyinhuaphagaChu larva at different time was observed, to understand the hemocyte types involved in the immunity response, to explore the mechanism of hemocyte immunity function and to provide scientific reference for developing effective microbial insecticides.

The results showed that deformation, disruption, nucleus shift and vacuole were found in the hemocytes ofH.jinyinhuaphagaChu larva after infected byE.coliat different dosages. In each time period, the total number of hemocytes was significantly higher than control, and increased rapidly over time. The peak was observed at 12 h, and started to decrease in 24 h. The proportion of prohemocytes decreased significantly at 3 h, and declined over time, until the lowest level was observed at 12 h, and started to increase at 24 h. But the proportion of plasmatocytes, granulocytes, spherulocytes, oenocytoids and cystocytes relatively increased, and reached the highest level at 12 h, then began to decrease at 24 h. Significant difference was observed among the proportions of the plasmatocytes, granulocytes and cystocytes (P<0.05) at each time period, but not for the spherulocytes and oenocytoids (P<0.05).

In conclusion, infection byE.colican cause hemocyte immune response inH.jinyinhuaphagaChu, and the plasmatocytes, granulocytes and cystocytes are the main hemocytes involved in the immune response.

Key wordsHeterolochajinyinhuaphagaChu;Escherichiacoli; hemocyte; immune response

病原物对自然界中的各种生物都会产生威胁，而每种生物都拥有自己的免疫系统，可以抵御病原物的侵害。在长期进化过程中，昆虫发展出了一套独特的免疫系统，即细胞免疫和体液免疫，通过它们的协同作用对入侵体内的病原物做出相应的免疫防御反应[1]。血细胞是细胞免疫的主要执行者，在昆虫防御外来病原物侵袭的过程中起着重要作用，其免疫防御机制一直为学者们所关注[2]。已有研究表明，当病原物侵入昆虫体内，血细胞通过血淋巴循环接触病原物，对它们进行吞噬，形成小结，凝集成瘤或包被[3-4]。然而在免疫反应中，病原物会产生一些毒素伤害血细胞，引起血细胞形态、数量及比例等发生一定的变化，如苏云金杆菌感染印度谷螟幼虫后，其血淋巴中血细胞受到破坏，多数血细胞出现空泡和变形，珠血细胞珠粒之间互相脱离，细胞膜破裂，细胞质外流，囊血细胞则有细胞外溢现象[5]；感染大链壶菌后，致倦库蚊幼虫浆血细胞和粒血细胞比例明显增加，原血细胞比例下降，在感染后96和120 h，原血细胞比例相对增加，珠血细胞和类绛血细胞所占比例越来越大，浆血细胞与粒血细胞比例相对减少，并且浆血细胞发生空泡、细胞变形等病理变化[6]。深入研究昆虫血细胞免疫反应可以为开发微生物杀虫剂提供科学依据，虽然这方面的研究已有一些报道，但是昆虫种类繁多，不同种类的昆虫参与免疫的血细胞种类可能不同，对外来入侵生物的细胞免疫反应也不尽相同[2]。因此，还需深入研究更多种类昆虫的血细胞免疫反应，探讨其血细胞免疫功能和作用机制，从而为害虫生物防治提供理论指导。

金银花尺蠖(HeterolochajinyinhuaphagaChu)是近年来新发现的在金银花上的主要食叶害虫之一，该虫为鳞翅目尺蛾科昆虫，别名拱腰虫，常造成金银花大面积减产，甚至成片死亡，给金银花生产带来严重损失。目前，国内对金银花尺蠖的研究主要集中于其生物学特性及防治上[7-8]，而对其血细胞免疫反应的研究尚未见报道。笔者在前期研究中已对金银花尺蠖幼虫血细胞的形态进行了观察，发现金银花尺蠖幼虫血淋巴中有原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞和囊血细胞6 种类型的血细胞[9]。在此基础上，本研究对大肠埃希菌感染后金银花尺蠖血细胞变化进行观察，以明确参与免疫反应的细胞类型，为探讨其血细胞免疫功能和作用机制，开发微生物杀虫剂防治该虫提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

供试虫源：金银花尺蠖幼虫采集于安徽省明光市三界镇野生金银花上，带回后在人工气候箱(RXZ-288A型，浙江宁波江南仪器制造厂)中用新鲜的金银花叶片饲养，光周期为昼夜比14 h/10 h，温度(25±1) ℃、相对湿度(70±7)%。选取大小一致的健康5龄幼虫作为试验材料。

供试菌种：大肠埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922由滁州学院微生物学实验室提供。

主要试剂：胰蛋白胨(山东青岛高科园海博生物技术有限公司)、酵母抽提物(湖北安琪酵母股份有限公司)、Wright染料(Sigma公司，美国)、Giemsa染料(AppliChem公司，德国)。

1.2方法

1.2.1大肠埃希菌菌悬液制备

大肠埃希菌ATCC25922用LB(Luria-Bertani)培养基在37 ℃下扩大培养至对数期，收集培养物，以2 000 r/min离心10 min，去上清液，取沉淀用无菌水制成1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108个/mL菌悬液待用。

1.2.2大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞数量与形态变化

用微量注射器吸取不同浓度的大肠埃希菌菌悬液3 μL，从幼虫腹部注入后，重新放入人工气候箱中用金银花叶片饲养。参考晏容等[3]的方法，分别于感染后3、6、12和24 h收集血淋巴，采用血球计数板于显微镜下观察血细胞总数的变化。取各时间段的血淋巴制成涂片，经Wright-Giemsa 染色，置于光学显微镜(XSG-109L型双目生物显微镜，上海精密仪器公司)下观察10个视野的血细胞并分类计数，了解各种血细胞数量及形态变化。以15只幼虫为1组，同时以注射无菌水的幼虫作为对照组，实验重复3次。

1.3数据统计

采用SPSS 11.5软件进行数据处理和统计学分析。

2结果与分析

2.1大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞的形态变化

大肠埃希菌感染后，金银花尺蠖幼虫血细胞聚集成堆(图1A)，形成集结和包囊，以浆血细胞和粒血细胞为主。6 h后参与反应的部分血细胞发生变形、破裂、核移位以及胞质出现空泡等变化，如浆血细胞失去其光滑完整的轮廓，形成皱褶或扭曲的外缘，细胞核偏向一侧，胞内出现大小和数目不等的空泡(图1B)；粒血细胞也出现变形和不同程度的空泡(图1C)；囊血细胞表面失去光滑完整的外部轮廓，外缘扭曲，凹凸不平，细胞表面破裂，细胞物质外流，细胞核向外溢出，细胞质疏密不均(图1D)。

A:血细胞聚集成堆(100×); B:浆血细胞(640×); C:粒血细胞( 640×); D:囊血细胞(400×).A: Aggregation of hemocytes (100×); B: Plasmatocytes (640×); C: Granulocytes (640×); D: Cystocytes (400×).图1　大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫的血细胞形态变化Fig.1　Morphological variation of hemocytes of H. jinyinhuaphaga Chu larva infected by E. coli

2.2大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞总数的变化

从表1中可以看出：分别感染1×103～1×108个/mL大肠埃希菌菌悬液后，金银花尺蠖幼虫血细胞总数较对照组均有显著增加，并且随着浓度的增大而不断增加，各浓度间的差异达统计学上的显著水平(P<0.05)；在感染后3、6和12 h范围内，随着时间延长血细胞总数不断增加，12 h时达最高水平，分别比对照增加17 478.52、20 330.77、23 189.48、25 888.51、29 434.62和34 044.06个/μL，各时间段的差异达统计学上的显著水平(P<0.05)，感染24 h之后血细胞总数开始下降。

2.3大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞比例变化

大肠埃希菌感染后不同时间金银花尺蠖幼虫各类血细胞比例呈现不同的变化(表2)。3 h时原血细胞的比例明显减少，并且随着浓度的增加明显减少，显著低于对照；随着时间的延长，原血细胞的比例不断下降，12 h时最低，分别比对照下降了14.51%、16.38%、18.05%、19.66%、21.38%和22.82%，各时间段之间的差异达统计学上的显著水平(P<0.05)；24 h时原血细胞数量又开始回升。感染后3 h，浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞的比例相对增加，其中，浆血细胞、粒血细胞和珠血细胞的比例显著高于对照(P<0.05)，而类绛血细胞和囊血细胞的比例与对照差异无统计学意义(P>0.05)；随着时间的延长，这5种血细胞的比例不断上升，6 h时与对照的差异均达统计学上的显著水平(P<0.05)；在12 h时达到最高，与对照相比，浆血细胞的比例增加了4.28%、4.77%、5.11%、5.25%、5.41%和6.64%，粒血细胞的比例增加了4.34%、4.62%、4.94%、5.20%、5.43%和5.78%，珠血细胞的比例增加了1.72%、1.24%、2.63%、3.14%、3.92%和4.30%，类绛血细胞的比例增加了2.00%、2.29%、2.55%、3.00%、3.26%和4.44%，囊血细胞的比例增加了2.17%、2.56%、2.82%、3.07%、3.36%和3.66%；浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞在各时间段的比例差异有统计学意义(P<0.05)，而珠血细胞和类绛血细胞差异无统计学意义(P>0.05)；这5种血细胞的比例在24 h时又开始下降。

表1　大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞总数的变化

表中数据为平均值±标准差；同列数据后的不同小写字母和同行数据后的不同大写字母均表示在P<0.05水平差异有统计学意义。

Data shown are means ± standard deviation. The values followed by different lowercase letters in the same column and ones followed by different capital letters in the same row both represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

表2　大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞的比例变化

续表2　大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞的比例变化

表中数据为平均值±标准差；同列数据后的不同小写字母和同行数据后的不同大写字母均表示在P<0.05水平差异有统计学意义。

Data shown are means ± standard deviation. The values followed by different lowercase letters in the same column and ones followed by different capital letters in the same row both represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

3讨论

昆虫血细胞是其细胞免疫的主要执行者，当病原性物质进入昆虫体内可引起血细胞数量、形态等发生一定的变化。笔者用大肠埃希菌感染金银花尺蠖幼虫后，观察到血细胞聚集成堆，形成集结和包囊，部分血细胞发生变形、破裂、核移位以及胞质出现空泡等变化。这与已有的研究结果[3,5]一致。

本实验还发现大肠埃希菌感染后不同时间金银花尺蠖幼虫血细胞总数较对照组均有显著增加，在感染后3、6和12 h范围内，随着时间延长血细胞总数不断增加，12 h时达最高水平，24 h之后血细胞总数开始下降。这与其他昆虫不太一致，如晏容等[3]报道，感染大肠埃希菌8 h后家蝇血淋巴细胞总数升高至最高水平，之后呈下降趋势；莫非等[6]报道，感染大链壶菌后致倦库蚊幼虫血淋巴细胞的总数在72 h升高至最高水平，之后呈下降趋势。这可能是由于不同种类的昆虫血细胞免疫反应速度不一致所引起的。研究表明，造血器官的制造、血细胞的分裂增殖及固着血细胞的释放都可以引起昆虫血细胞总数的增加[4]，但造血器官制造血细胞和血细胞分裂增殖的速度都比较慢，难以在短时间内产生大量的血细胞。因此，推测大肠埃希菌感染后幼虫血细胞总数的增加，可能是由于幼虫在受到免疫刺激后很快释放出固着的血细胞参与免疫反应，而后期血细胞数量的增加可能是造血器官的制造及血细胞分裂增殖的结果。随着感染时间的延长，大量的血细胞参与免疫反应而被消耗掉，使得所消耗的血细胞数量多于所产生的血细胞数量，从而引起血细胞总数下降[4]。

大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞比例呈现不同的变化。3 h时原血细胞的比例明显减少，随着时间的延长，比例不断下降，12 h时降至最低水平，24 h之后开始回升；而浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞的比例相对增加，12 h时升至最高水平，24 h之后开始下降，浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞在各时间段的比例差异显著，而珠血细胞和类绛血细胞差异不显著。这说明浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞是免疫反应的主要参与者，在抵御病原物感染过程中发挥了重要作用。在感染早、中期，金银花尺蠖幼虫体内诱发了明显的免疫反应，诱导这3类血细胞大量地增殖和释放，比例明显增加，到了感染晚期，原血细胞的分化和增殖功能减弱，浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞比例则相对减少。晏容等[3]的研究表明，浆血细胞和粒血细胞是家蝇体内免疫反应的主要参与者，大肠埃希菌感染后4、8和16 h，家蝇浆血细胞和粒血细胞比例明显增加，而珠血细胞在感染后各时间段的比例均明显减少，原血细胞和类绛血细胞比例则无明显变化。这进一步说明不同种类的昆虫体内参与免疫反应的血细胞种类及数量变化不尽一致。

总之，大肠埃希菌感染金银花尺蠖幼虫后引起幼虫血细胞的形态、数量及各类细胞的比例都发生了相应的变化，显示幼虫体内发生了一定程度的免疫防御反应。血细胞既是细胞免疫反应的执行者，又是体液免疫因子的提供者。体液因子可以在血细胞中合成并释放，参与异物的杀灭、清除。关于血细胞与体液因子在免疫中的关系有待进一步深入研究。

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中图分类号Q 969.93

文献标志码A

收稿日期(Received)：2015-05-25；接受日期(Accepted)：2015-10-26；网络出版日期(Published online)：2016-03-20

*通信作者(

Corresponding author)：向玉勇(http://orcid.org/0000-0001-9335-2256)，E-mail:xyy10657@sohu.com

基金项目：安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2012B123)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201310377018).

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160321.1424.012.html