纯净水对斑马鱼幼鱼生长发育的影响

◎朱加进，蔡 赫

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310000）

较其他模式生物，斑马鱼具有完整的器官和系统，且同人类基因组具有高达87%的同源性[1]，它的体积小、繁殖能力强、生长发育迅速、养殖成本低，可缩短药物筛选实验的周期、提高筛选效率，因此备受药学研究者的青睐，如利用斑马鱼建立疾病模型、进行药物活性成分的高通量筛选等。在病理学方面，由于斑马鱼突变技术的研究发展，研究者们建立了斑马鱼遗传图谱，分析了有价值的突变体，发展了转基因斑马鱼技术，这些都成为毒理学研究的优良资源。目前，斑马鱼已被广泛应用于遗传和发育毒理学、环境毒理学、病理毒理学、药物毒理学等毒理学领域，并展现出其独特的优势[2,3]。

水环境对斑马鱼的生长、发育及行为学方面有很大的影响，国际标准组织（ISO）已将斑马鱼推荐为河水毒性实验鱼种并制定了相应的标准（ISO 07346）。我国参照国际标准，于1991年出台了国家标准《水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法》（GB/T 13267-1991），使用斑马鱼进行水质安全性的检测已获国内外认可并得到了广泛应用。

目前市场上的饮用水品牌琳琅满目，但从加工工艺来看，主要可分为天然水和纯净水两类。天然水主要以地表的山、河、湖、泊和地下泉水为主要水源，经过简单的处理工艺，在去除原水中极少的杂质和有害物质的同时保存原水中对人体有益的矿物质元素。纯净水主要以市政自来水为水源，经过反渗透工艺在除去有害物质的同时也基本完全去除各种矿物元素。饮用水中矿物离子对机体的重要性已有很多报道，但运用斑马鱼模型来研究饮用水中矿物元素对机体健康影响在国内外还鲜有报道。因此，本研究采用斑马鱼模型，对水中矿物质离子对机体生长发育的重要性作初步评价并从形态学角度探究纯净水对斑马鱼的致畸作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

斑马鱼受精卵由浙江大学生命科学学院提供，为野生AB型。

1.2 试剂及其配制

养鱼用水配制：准确称取2.264 0 g NaCl，0.074 5 g KCl，0.405 1 g HEPES和0.266 4 g无水CaCl2，用蒸馏水于1 L容量瓶定容后用3 M NaOH调pH至7.2后备用。

4%甲基纤维素配制：准备称取4 g甲基纤维素于100 mL的热水中搅拌溶解后于4 ℃冰箱中冷藏过夜后备用。

天然水及纯净水，均购于市场。

1.3 仪器

体式显微镜（奥林巴斯），心率血流测试系统（viewpoint公司）。

1.4 实验方法

将野生AB型斑马鱼受精卵置于盛有养鱼用水的培养皿中于28.5 ℃培养箱中孵化，2 dpf后用体式显微镜剔除发育异常的斑马鱼幼鱼。本次试验对象为3组水样，分别为纯净水组，天然水组和正常对照组（养鱼用水）。取六孔板，每孔吸入30尾2 dpf幼鱼并分别加入10 mL的上述水样，每组样品一个复孔于28.5 ℃培养箱中孵化，24 h换液一次。

在5 dpf时从每组样品中随机挑选10尾鱼用4 %甲基纤维素溶液固定后用体式显微镜和心率血流测试系统对斑马鱼幼鱼生长发育（体长、身体侧面投影、卵黄囊面积、眼大小和侧翻率）及致畸性等指标（脊柱弯曲、心率）进行观察分析。

1.5 数据处理

本文中数据均采用spss16.0进行独立t-检验分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 纯净水对斑马鱼幼鱼生长发育的影响

纯净水对斑马鱼幼鱼生长发育的影响（见图1）。

图1 纯净水对斑马鱼幼鱼生长发育的影响图

如图1所示，纯净水组斑马鱼的体长、身体侧面投影、眼大小分别为：

（3.59±0.12）mm

（1.06±0.07）mm2

（0.24±0.02）mm2

均显著低于天然水组的：

（3.72±0.14）mm

（1.15±0.05）mm2

（0.27±0.02）mm2

与正常对照组的：

（3.74±0.12）mm

（1.15±0.06）mm2

（0.26±0.02）mm2

卵黄囊面积纯净水组为（0.55±0.09）mm2，显著高于天然水组的（0.41±0.09）mm2及正常对照组的（0.44±0.10）mm2。在上述指标中，天然水组与正常对照组均无统计学差异。由此可见，与其他两组相比，纯净水能显著延缓斑马鱼幼鱼的生长发育。

2.2 纯净水对斑马鱼的致畸性的研究结果

如图2所示，纯净水组斑马鱼的心率为（126.6±8.54）bpm，显著低于天然水组（141.6±5.56）bpm及正常对照组（142.4±5.94）bpm，天然水组与正常对照组无差异。

图2 纯净水对斑马鱼心率的影响图

如图3所示，养殖在纯净水组中的斑马鱼幼鱼有脊柱弯曲的现象。由此可知，纯净水对斑马鱼幼鱼有明显的致畸作用。

3 讨论

矿物元素与机体健康有着重要的关系。钙是人体必需的常量元素之一，它不仅是骨骼组成的主要构成部分，在机体生长发育过程中也起着重要的作用[4]。Zemel[5]等人通过实验发现降低细胞内钙离子浓度会抑制脂肪分解代谢进而影响脂肪等物质的吸收。除钙外，镁也是人体细胞内重要的元素，黄永祥 等[6]研究表明镁具有多种特殊的生理功能，它能激活体内多种酶、抑制神经异常兴奋性、维持核酸的结构的稳定性、参与体内蛋白质的合成、肌肉收缩及体温调节，同时镁影响钾、钠、钙离子细胞内外移动的通道，并有维持生物膜电位的作用。

饮用天然水由其处理工艺的原因，在除去少量有害物质的同时还保留了大部门对人体有益钙、镁元素和其他多种微量元素。水中矿物元素对机体健康的影响已有大量文献报道，陈荣河 等[7]对3月龄的ICR小鼠进行90 d的研究表明，长期饮用纯净水对小鼠的抗氧化酶及脂代谢指标均有一定的影响。周宇红 等[8]对小鼠进行近4个月的跟踪考察实验，发现与饮用天然水相比，长期饮用纯净水会显著延缓仔鼠的生长发育。胡启之 等[9]对4月龄的ICR小鼠3个多月的跟踪考察实验也发现也发现长期饮用纯净水具有延迟仔鼠生长发育的趋势。

以前的研究学者基本上是用大小鼠作为模式动物进行矿物离子与机体健康的研究，但周期较长、成本高，本实验运用考察周期更短的斑马鱼模型（考察周期仅为3 d）对水中矿物元素对机体健康的影响进行研究。据本实验可知，纯净水能延迟斑马鱼幼鱼的生长发育，这与前人用大小鼠研究的结论“长期饮用纯净水具有延迟仔鼠生长发育”基本一致。

在本次实验过程中发现，纯净水能显著降低斑马鱼幼鱼的心率并伴有脊柱弯曲等致畸现象出现，这可能与纯净水中缺乏钙、镁等矿物元素有关。有文献表明，长期缺钙可引起婴儿出现佝偻病的危险，缺镁可引起机体的心率失常[10,11]。由此可见，运用斑马鱼作为模式动物能在较短的时间内更全面地评价纯净水对机体健康的影响。

参考文献：

[1]常 嘉，陆 亮，林金杏，等.斑马鱼胚胎发育毒性评价方法的建立[J].世界临床药物，2013，34（11）：660-664.

[2]李洁斐，李卫华，王强毅，等.斑马鱼应用于毒理学研究的现况[J].实验动物与比较医学，2005，25（4）：247-252.

[3]李乙根，黄文瑾，黄 诚.斑马鱼在新药发现中的应用[J].生命科学，2011，23（3）：273-278.

[4]姚 莉，段玉峰.钙在人体中平衡与健康[J].广东微量元素科学，2004，11（3）：6-11.

[5]Zemel MB，Shi H，Greer B，et al. Regulation of adiposity by dietary alcium[J].FASEB J,2000，（4）：1132-1138.

[6]黄永祥.镁与人的健康[J].中外健康文摘，2009（11）：234-235.

[7]陈荣河，陈 楚，沈惠真，等.水质对小鼠肥胖相关指标影响[J]中国公共卫生，2014，30（4）：454-456.

[8]周宇红，耿桂英，冯水全，等.新型饮水对小鼠繁殖及抗氧化酶活性的影响[J]2003，19（12）：1429-1430.

[9]胡启之，俞 萍.低钙饲料和纯水对小鼠胚胎和仔鼠生长发育的影响[J]环境与职业医学，2002，19（3）：195.

[10]高学习.佝偻病患儿微量元素分析[J].临床医学，2011，30（28）：61.

[11]雷润华.镁在心脑血管疾病防治中的应用[J].中国民族民间医药，2009，18（20）：122.