Gene X-pert Mtb/RIF检测技术与抗酸染色和BD960培养、药敏的比对研究

布红丽，张　丽，智霞萍，杨顺利

(太原市第四人民医院，山西 太原　030053)



·临床医学·

Gene X-pert Mtb/RIF检测技术与抗酸染色和BD960培养、药敏的比对研究

布红丽，张丽，智霞萍，杨顺利

(太原市第四人民医院，山西 太原030053)

[摘要]目的：评价Gene X-pert Mtb/RIF检测痰标本诊断结核病和结核菌对利福平耐药的效能。方法：采用2014年10月～2015年7月太原市第四人民医院收集的确诊结核病患者的痰标本进行涂片、BD960培养、BD960药敏试验及Gene Xpert Mtb/RIF检测，应用统计学方法对Gene Xpert Mtb/RIF与不同检测方法进行敏感度分析。结果：Gene X-pert Mtb/RIF检测技术敏感度均高于涂片和BD960培养(P<0.05)，利福平耐药与BD960利福平耐药无统计学差异(P>0.05)。结论：Gene Xpert Mtb/RIF检测技术是一种快速、自动化程度高、操作简便的结核病分子生物学诊断技术，为临床快速诊断结核病及是否对利福平耐药提供了有力的实验室佐证。

[关键词]结核病；涂片；Gene Xpert Mtb/RIF检测；BD960培养

1资料与方法

1.1一般资料

收集太原市第四人民医院2014年10月～2015年7月住院的结核患者200例，男110例，女90例；其他呼吸道(非结核病)疾病患者30例，其中肺癌患者8例，支气管扩张10例，慢性阻塞性肺病12例。

1.2仪器、试剂

抗酸染色液生产厂家为珠海贝索生物技术有限公司；培养及药敏所用仪器为美国碧迪医疗器械有限公司生产的BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌检测系统，试剂均为BD960配套试剂，由碧迪医疗器械有限公司提供；Gene Xpert Mtb/RIF仪器及试剂由美国Cepheid公司提供；结核杆菌标准菌株由国家CDC结核病参比实验室提供。

1.3研究方法

1.3.1涂片抗酸染色涂片抗酸染色按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求操作。

1.3.2培养及菌种鉴定同时进行BD960液体快速培养，培养阳性标本再进行BD960药敏试验，操作如下：痰液标本的前处理：a) 挑去5 mL痰液至50 mL已标记的离心管中；b) 加等量的2%NALC-NaOH前处理液，强力旋涡振荡20 s；c) 室温静置15～20 min；d) 加无菌PBS(PH6.8)至约50 mL，盖紧盖子，离心3 000转，15 min，倒掉上清液；e) 添加1～3 mLPBS(PH6.8)以制备成悬浊液。标本接种：标本接种前，在MGIT 7 mL培养管中先加入0.8 mLGrowth Supplement溶解后的PANTA(杂菌抑制剂)；接种0.5 mL处理后的标本至BBL MGIT培养管中，然后上机检测，报告阳性者同时做涂片抗酸染色确认，注意涂片染色阳性的分支杆菌并不都是结核菌，只是抗酸染色阳性。阳性同时做菌种鉴定，接种在浓度为50 μg/mL对硝基苯甲酸培养基上。

1.3.3药敏试验报阳1 d或2 d，无需稀释，颠倒混匀后准备直接接种，报阳第3天至第5天。取1 mL阳性肉汤到4 mL无菌生理盐水，混匀(1∶5稀释)，加0.8 mLBACTECTM MGITTM960 SIRE添加剂至每一试管，加100 μL利福平药物至标记好的MGIT管，再加入菌液0.5 mL，将准备好的MGIT管放入标记好的AST试管架，并按放管程序放入BACTEC MGIT960仪器中进行检测。

1.3.4Gene Xpert Mtb/RIF检测至少收集1 mL痰液样品，装入50 mL离心管中，加入Gene Xpert样品试剂2∶1，盖好盖子，剧烈摇动10～20次，室温培养15 min，使用试剂盒提供的专用无菌移液管，将液化的样品吸入，直至弯月面在移液管的最低标记处，打开检测盒子，将处理好的样品由检测盒的加样孔缓慢加入，不要产生气泡，确保盖子盖紧，将样品反应盒放入Gene Xpert仪器的样品舱中进行DNA的提取、PCR扩增和结果的检测，通过专用软件判读结果。

1.4统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1诊断情况

200例住院患者按照《肺结核诊断和治疗指南》(中华医学会结核病分会)诊断为结核病患者[1]，30例诊断为非肺结核病患者。

2.2细菌学检测结果

200例住院患者痰涂片显微镜检查，其中涂片阳性68例(34%)，涂片阴性132例(66%)，结核杆菌标准菌株涂片阳性。其中192例住院患者进行BD960培养(8例由于其他原因未进行BD960培养培养)，阳性结果108例(56.25%)，培养阴性结果84例(43.75%)，结核杆菌标准菌株培养阳性，经菌种鉴定为结核分枝杆菌的191例，非结核分枝杆菌1例。107例结核分枝杆菌培养阳性患者进行BD960药敏试验(1例非结核分枝杆菌未做BD960药敏试验)，对利福平耐药32例(29.9%)。30例非结核患者涂片抗酸染色镜检阳性1例，经PNB菌种鉴定为非结核分枝杆菌；阴性29例，BD960培养阳性0例，阴性30例。

2.3Gene Xpert Mtb/RIF检测结果

200例住院患者经Gene Xpert Mtb/RIF检测阳性结果136例(68%)，阴性结果68例(32%)，30例非结核病患者经Gene Xpert Mtb/RIF检测阳性结果1例，阴性29例，结核杆菌标准菌株检测阳性。经Gene Xpert Mtb/RIF检测136例阳性结果中利福平耐药45例(33.1%)，BD960药敏试验利福平耐药患者32例， Gene Xpert Mtb/RIF检测均耐药(见表1)。

表1　Gene Xpert Mtb/RIF检测结果　　例

2.4Gene Xpert Mtb/RIF检测灵敏度和特异度比较分析

200例肺结核患者中，阳性136例，提示该方法敏感度为68%(136/200)，30例非结核患者中阴性为29例，表明该方法的特异度为96.67%(29/30)(见表1)。

2.53种方法检测结果分析

200例住院患者进行涂片检查，涂片阴性132例，涂片阳性68例，阳性率34.00%，其中192例患者做了BD960结核菌培养，阴性84例，阳性108例，阳性率56.25%，与Gene Xpert Mtb/RIF检测结果比较，阳性率差异有统计学意义(χ2=36.70,P<0.05)。BD960利福平耐药测定和Gene Xpert Mtb/RIF耐药测定两组比较差异无统计学意义(χ2=2.11，P>0.05)(见表2)。

表2　3种方法检测结果比较分析　　例

3讨论

由于分枝杆菌培养及其核苷酸扩增的技术较为复杂，全球“仅少数”患有耐药肺结核的患者可获得充分敏感的诊断性检测和药物敏感性测试。全球范围内，无效的肺结核检测、不断增长的多药耐药和广泛耐药的肺结核致使在肺结核流行的国家需要大力提高结核杆菌的培养和耐药性检测能力[2]。

Xpert MTB/RIF 核酸检测采用Cepheid公司Gene xpert检测系统，是世界上唯一的全自动一体化实时定量PCR体外诊断技术；全自动医用PCR分析系统能自动完成并整合以下过程；核酸提取，扩增以及目标序列，在单或者复杂样品中的检测，采用一次性特定分析用Gene xpert检测盒制备和处理样本，将是样本和所需试剂加入到检测盒中，然后将试剂盒放到一个可用的设备模块之中。Xpert MTB/RIF检测技术针对rpoB基因81bp利福平耐RRDR区间设计引物，探针，检测其是否发生突变进而用于诊断患者是否结核以及是否利福平耐药(rpoB序列存在突变)[3]。本研究Gene xpert检测结核杆菌敏感度均高于痰涂片和BD960培养，利福平耐药率与BD960检测利福平耐药率比较，无统计学差异(P>0.05)。利福平作为重要的抗结核药物，被世界卫生组织推荐为治疗结核病的一线药物，耐利福平结核病危害严重。世界卫生组织将同时对利福平和异烟肼耐药的结核病称为MDR—TB，MDR—TB治疗时间长，治疗难度大，治疗费用高，治愈率低，已成为结核病控制的难题。Xpert MTB/RIF 核酸检测全程只需2.5 h，与也属于快速培养的BD960比较，检测结果更加快速，可以在第一时间诊断患者是否结核及是否对利福平耐药，为结核病的早期快速诊断提供了实验室的诊断依据。因此，世卫组织遏制结核病司司长Maoio Rarig lione博士评价Xpert MTB/RIF检测方法是全球结核病诊断和治疗方法的一个重要里程碑，为患结核病和耐药结核病危险的数百万人带来了新希望。但是该方法也有它的局限性，仅能检测利福平耐药，缺乏对异烟肼耐药的检测，不能快速诊断出MDR-TB，且仪器及试剂均很昂贵，这些均会限制其应用。

总之，Xpert Mtb/RIF检测操作简单、快速,不易造成交叉污染，对生物安全性要求很低并且检测敏感度高于涂片镜检法，BD960液体培养，同时该方法可以诊断患者是否对利福平耐药,在我国结核病实验室诊断方面具有非常好的应用前景。

[参考文献]

[1]中华医学会结核病分会.肺结核诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2001,24(2):70-74.

[2]胡忠义.结核病耐药检测技术进展及存在的问题和对策[J].中国防痨杂志,2014,35(11)：865-867.

[3]李辉，谭耀驹，李洪敏，等.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术的诊断效果对比研究[J].中国防痨杂志,2014,36(6)：472-476.

本文编辑：王知平

The Comparison Research on Gene X-pert Mtb/RIF Detection Technology and Acid Fast Stain and BD960 Culture and Drug Sensitivity

BU Hongli,ZHANG Li,ZHI Xiaping,YANG Shunli

(TheFourthPeople'sHospitalofTaiyuan,Taiyuan030053,Shanxi,China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the efficiency of Gene X-pert Mtb/RIF detection of sputum specimens diagnosis of TB on drug resistant tuberculosis bacterium of rifampicin.Methods: The sputum specimens diagnosed cases of tuberculosis patients from Oct.2014 to July 2015 were conducted a smear, BD960 cultivated, BD960 drug sensitive test and Gene X-pert Mtb/RIF detection.The sensitivity analysis based on the a statistical approach were achieved on Gene X-pert Mtb/RIF and the different test methods.Results: The sensitivity of Gene X-pert Mtb/RIF detection technology was higher than the smear, BD960 cultivation(P<0.05). There was no statistically significant difference in the drug resistance of rifampicin and BD960 drug resistance of rifampicin(P>0.05). Conclusion: Gene X-pert Mtb/RIF detection technology is a kind of Tuberculosis (TB) diagnosis technology of molecular biology, which is fast, convenient to use automatically.It provides a powerful laboratory evidence to perform the rapid diagnosis of tuberculosis (TB) and judge whether the rifampicin resistants in the clinic treatment.

[KEYWORDS]tuberculosis (TB); smear; Gene X-pert Mtb/RIF detection; BD960 cultivation

[中图分类号]R446.5

[文献标识码]A

[文章编号]1671-0126(2016)01-0011-03

[作者简介]布红丽，女，副主任技师，从事医学检验工作