全自动免疫组化筛查ALK基因融合非小细胞肺癌及其病理特征

冯　强，彭　森，刘　霞

(徐州市中心医院，江苏 徐州 221009)



全自动免疫组化筛查ALK基因融合非小细胞肺癌及其病理特征

冯强，彭森，刘霞

(徐州市中心医院，江苏 徐州 221009)

摘要：目的 探讨全自动免疫组化筛查间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因融合非小细胞肺癌的临床特点及病理特征.方法 选取经病理检查确诊的554例非小细胞肺癌组织，采用Ventana抗ALK试剂和全自动免疫组化(IHC)染色检测ALK状态，分析ALK基因融合非小细胞肺癌的临床特点和病理特征.结果 本次研究的554例非小细胞肺癌患者组织中，共筛选出34例ALK阳性，占6.14%；年龄<60岁的非小细胞肺癌患者ALK阳性率8.69%，明显高于年龄≥60岁的3.62%，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；男性患者ALK阳性率6.71%高于女性5.21%，但差异无统计学意义(P>0.05).组织形态学方面，34例ALK阳性非小细胞肺癌中28例为肺腺癌，6例为非肺腺癌.16例实体型为主腺癌合并黏液产生，7例腺泡型为主腺癌，1例为乳头型为主腺癌，4例为浸润性黏液腺癌，4例为鳞状细胞癌.EGFR基因突变检测显示：仅有1例合并该基因突变，其余均为野生型.9例IHC阳性样本，9例ALK基因融合非小细胞肺癌，9例IHC阴性样本经荧光原位杂交技术检测和RT-PCR检测均为阴性结果，6例IHC染色可能为阳性，经荧光原位杂交技术检测均显示为ALK融合阴性.结论 ALK基因融合肺癌是非小细胞肺癌一新的分子亚型，具有独特的临床表现和病理形态；Ventana抗ALK试剂和IHC染色是检测ALK阳性非小细胞肺癌首选方法，对提高该类型肺癌的检出率及个体化治疗具有重要意义.

关键词：非小细胞肺癌；全自动免疫组化；间变性淋巴瘤激酶

【引用格式】冯强，彭森，刘霞.全自动免疫组化筛查ALK基因融合非小细胞肺癌及其病理特征[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(2)：209-212.

非小细胞肺癌为肺癌中最常见的一类，约占肺癌患者的80%[1].近10 a中，随着分子病理学的快速发展，发现表皮生长因子受体(EGFR)突变已成为非小细胞肺癌最常见的基因改变[2].最近，该领域研究者又发现一类新亚型ALK基因融合非小细胞肺癌，对简变性ALK抑制剂克唑替尼具有高敏感性[3]，因此，通过对ALK状态的检测来筛选出适合接受靶向治疗的肺癌患者已成为病理学研究者的共同目标.本次研究收集了554例非小细胞肺癌样本，采用Ventana抗ALK试剂和全自动免疫组化(IHC)染色筛选ALK阳性非小细胞肺癌，同时用RT-PCR、荧光原位杂交技术验证，探讨其临床特点和病理特征.

1材料与方法

1.1材料

选取经病理检查确诊的非小细胞肺癌石蜡包埋组织554份，其中包括手术切除肺叶、皮肺穿刺、转移病灶的非小细胞肺癌标本，病案室提供相关临床资料，患者或其家属提供预后资料.

1.2方法

1.2.1标本处理

收集的标本用4%甲醛溶液固定，自动脱水后用石蜡包埋，5 μm切片，行HE染色、AB-PAS特殊染色、IHC染色.其中AB-PAS特殊染色具体为：石蜡切片脱蜡至水，Schiff液和pH 2.5的爱先蓝液染色，中性黏多糖显示为红色，酸性黏多糖显示为蓝色，两组复合成分为紫色.IHC染色具体为：采用EnVision法染色、Ventana NexES全自动免疫组化染色系统和抗间变性淋巴瘤激酶(ALK)兔单抗试剂盒对ALK蛋白表达情况进行检测，均有阴性和阳性对照，若肿瘤细胞质中出现棕黄色颗粒即为ALK阳性.

1.2.2RT-PCR检测

采用Qiagen纯化试剂盒提取、纯化石蜡组织中的RNA，用人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒(荧光PCR法，北京雅康博生物科技有限公司)检测A20，E6；A20，E2；A20，E14等9种融合突变体.

1.2.3荧光原位杂交技术检测

采用ALK双色分离探针，该基因的3′端和5′端分别标记红色、绿色荧光信号.具体为：样本先通过HE染色对癌区定位，荧光显微镜视野下查看200个肿瘤细胞；ALK野生型表现为红绿色合并黄色信号，当20%以上的肿瘤细胞ALK位点出现以下两种信号时，可判断为ALK重排阳性：同时存在黄色信号，红色、绿色信号各一个，红色、绿色信号间距大于2倍信号点宽度；同时存在黄色信号和一个红色信号.

1.2.4EGFR基因突变检测

采用FFPE DNA Kit石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，抽提样本中的DNA；采用Scorpions ARMS法检测EGFR基因的4种突变状态；操作严格按照试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书进行.

1.3统计学分析

本次研究中数据应用SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较采用χ2检验，以α=0.05为校验水准.

2结果

2.1ALK阳性非小细胞肺癌筛选及临床特征

本次研究的554例非小细胞肺癌组织中，共筛选出34例ALK阳性，占6.14%.554例非小细胞肺癌患者年龄25～89岁，平均(60.82±12.43)岁；34例ALK阳性患者年龄29～81岁，平均(52.41±10.80)岁.年龄<60岁的非小细胞肺癌患者ALK阳性率为8.69%(24/276)，明显高于年龄≥60岁的3.62%(10/276)，差异具有显著统计学意义(χ2=9.388，P=0.001).男性患者ALK阳性率6.71%(23/343)高于女性5.21%(11/211)，但差异无统计学意义(χ2=0.162，P=0.785).

2.2ALK阳性非小细胞肺癌的病理形态学特征

34例ALK阳性非小细胞肺癌中82.35%(28/34)为肺腺癌，17.65%(6/34)为非肺腺癌，共32例含腺癌成分；47.05%(16/34)实体型为主腺癌合并黏液产生，AB-PAS特殊染色呈阳性，见图1-A～D；7例腺泡型为主腺癌，其中3例为黏液筛状结构，见图1E～F；1例为乳头型为主腺癌，4例浸润性黏液腺癌，见图1-G；4例为鳞状细胞癌，见图1-H.

2.3ALK阳性非小细胞肺癌的基因检测情况

34例ALK阳性非小细胞肺癌行EGFR基因突变检测，其中仅有1例合并该基因突变，其余均为野生型.9例IHC阳性样本，见图2-A，其中8例经荧光原位杂交技术检测显示出ALK分离信号，见图2-B，1例操作失败.9例经RT-PCR检测验证为ALK基因融合非小细胞肺癌.9例IHC阴性样本经荧光原位杂交技术检测和RT-PCR检测均为阴性结果.6例IHC染色可能为阳性，经荧光原位杂交技术检测均显示为ALK融合阴性.

2.4非小细胞肺癌患者靶向治疗预后情况

对34例ALK阳性非小细胞肺癌患者行为期3～58个月的随访，其中1例失访，其余均有完整随访资料.14例患者给予靶向药物(克唑替尼)治疗1～6个疗程，平均4个疗程，其中11例治疗后病情缓解或稳定，治疗缓解比11/14，其余3例患者分别治疗2，1，4个疗程后病情出现进展.

3讨论

继炎性肌纤维母细胞瘤、淋巴瘤中探寻出多种类型ALK基因重排之后，近年来研究者又报道肺腺癌患者存在一种新的ALK融合基因.在非小细胞肺癌中EML4基因融合为ALK最常见的融合形式，分别由位于2P21，23的EML4，ALK基因倒位融合为新的EML4-ALK基因，同时还有TFG-ALK等类型的稀有融合，其在非小细胞肺癌病情进展中具有相同的生物学特性，检测出的ALK状态也具有分子诊断及靶向治疗的意义[4].目前多采用荧光原位杂交或PCR技术来检测非小细胞肺癌的ALK状态.本次研究选用Ventana-IHC法对554例非小细胞肺癌样本进行检测，共筛选出34例ALK阳性样本，并进一步分析其临床特征、病理形态、治疗预后情况.

非小细胞肺癌的ALK检测方法包括荧光原位杂交技术、RT-PCR、IHC.荧光原位杂交技术对标本前处理、肿瘤判读有较高要求；RT-PCR对RNA提取有较高要求，引物设计难度大；IHC简单易行，适合筛查.虽然国外认为荧光原位杂交技术为检测非小细胞肺癌中ALK的金标准[5]，但研究者对比了非小细胞肺癌检测方法与IHC方法ALK阳性检出率，结果显示两者的假阴性率均大于20%[6]，因此需要两种方法相互验证.

本次研究显示：ALK阳性非小细胞肺癌患者平均年龄约小于阴性患者10岁，男性患者比率高于女性患者.腺癌的ALK融合率明显高于其他亚型，肺腺癌中发生率最高的腺泡亚型不常见于ALK基因融合，而多为实体型.此外，本次研究中多数病例合并程度不同的细胞内外黏液，与相关研究结果一致[7]，进一步证实了ALK阳性非小细胞肺癌与黏液的分泌以及实体型腺癌形态结构有关.

相关研究显示：非腺癌亚型非小细胞肺癌亦存在ALK基因融合，肺腺鳞癌ALK阳性率为6.1%，纯鳞状细胞癌ALK的阳性率也高达3.2%[8].本次研究中含鳞状细胞癌成分的非小细胞肺癌表现为ALK弥散性强阳性.可见含鳞状细胞癌成分的非小细胞肺癌同样需要选择性检测ALK状态.

研究显示：非小细胞肺癌中ALK基因融合与其他基因突变事件之间为相互独立事件，但亦有研究认为可合并EGFR或其他基因[9].本次研究中也发现1例80岁高龄患者存在腺泡为主要型态的EGFR突变或ALK基因融合，其与上述的ALK阳性非小细胞肺癌临床病理特点不完全吻合，待进一步收集该类病例进行深入研究.

参考文献：

[1] 徐鸿洁.吉非替尼靶向治疗非小细胞肺癌的研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2010，11(4)：340-343.

[2] 郭蕾，郑闪，谢永强，等.非小细胞肺癌间变性淋巴瘤激酶融合基因的荧光原位杂交检测规范化流程探讨[J].中华病理学杂志，2013，42(8)：530-533.

[3] 黄晓琳，曹子昂.EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌[J].国际肿瘤学杂志，2012，39(3)：212-214.

[4] 杨杨，干惠珠，卢振霞，等.非小细胞肺癌中EML4-ALK融合基因的研究进展[J].中国实验诊断学，2013，17(8)：1540-1543.

[5] 张一方.EML4-ALK融合型非小细胞肺癌特性的生物信息学分析及下游STAT3基因的功能验证[D].广州：南方医科大学，2012.

[6] 侯丹阳，邵璐，徐傲，等.免疫组化检测非小细胞肺癌ALK融合基因表达异常[J].临床与实验病理学杂志，2015，31(5)：542-547.

[7] 吴翠翠，修冬莹，张雪琦，等.肺癌患者血清P53抗体及肺癌组织P53表达对肺癌诊断价值的研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2014，15(4)：486-489.

[8] 张梦雪，裴斐，王田力，等.95例非小细胞肺癌患者的间变性淋巴瘤激酶融合基因表达情况、临床病理特点及预后[J].北京大学学报(医学版)，2014，46(4)：582-588.

[9] 李延峰，叶惠龙.检测非小细胞肺癌患者手术前后血清TGF-α与CA21-1水平的临床意义[J].重庆医学，2014，43(16)：2057-2059.

【责任编辑：陈丽华】

Screen of Non-small Cell Lung Cancer with Anaplastic Lymphoma Kinase Fusion Gene by Automatic Immunohistochemical Method and Its Pathological Features

Feng Qiang，Peng Sen，Liu Xia

(CentralHospitalofXuzhou，Xuzhou221009，China)

Abstract：Objective To explore the automatic immunohistochemical method for the screen of non-small cell lung cancer with anaplastic lymphoma kinase(ALK)and its clinical pathological features.Methods 554 cases of non-small cell lung cancer diagnosed by pathological examination were enrolled in this study.The status of ALK was detected by Ventana anti ALK reagent and IHC staining，and the clinical characteristics and pathological features of ALK gene were analyzed.Results Among of 554 patients with non-small cell lung cancer，34 cases showed positive ALK(6.14%).The positive rate of the patients under 60 years old(8.69%)was significantly higher than that of the elder patients(3.62%)(P<0.01).The positive rate of male patients (6.71%)was higher than female patients(5.21%)，but the difference was not statistically significant(P>0.05).The results of tectology found that，among of 34 cases with ALK positive non-small cell lung cancer,28 cases were lung adenocarcinoma,5 cases were not lung adenocarcinoma，16 cases were solid adenocarcinoma with grume，7 cases were alveolar adenocarcinoma，1 case was papillary carcinoma，4 cases were invasive mucinous adenocarcinoma，and 4 cases were squamous cell carcinoma.EGFR gene mutation test showed that only 1 case combined with the mutation，and the rest were all wild type.Besides，9 cases were IHC positive samples，9 cases were non-small cell lung cancer with ALK gene fusion，9 cases were IHC negative samples determined by fluorescence in situ hybridization and RT-PCR detection.The other 6 cases of possible positive by IHC staining were determined to be ALK fusion negative by fluorescence in situ hybridization.Conclusion ALK gene fusion lung cancer is a new molecular subtype of non-small cell lung cancer.It has unique clinical feature and pathological morphology.Ventana anti ALK reagent and IHC staining method are the first choice for the test of ALK positive non-small cell lung cancer，which has important significance to improve the detection rate and individual treatment for this type of lung cancer.

Key words：non-small cell lung cancer；automatic immunohistochemistry；anaplastic lymphoma kinase

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

作者简介：冯强(1972-)，男，主任医师，主要从事病理学研究，E-mail：3976521339@qq.com.

基金项目：江苏省青年基金项目(BK20141026).

收稿日期：2015-09-10

文章编号：1009-4822(2016)02-0209-04

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.014