蓝莓对非酒精性脂肪肝大鼠Nqo1蛋白表达的影响*

赵旦博， 任婷婷， 程明亮**， 禹　萍

(1.贵州医科大学 感染病学教研室, 贵州 贵阳　550004； 2.贵州医科大学 生化教研室， 贵州 贵阳　550004)



蓝莓对非酒精性脂肪肝大鼠Nqo1蛋白表达的影响*

赵旦博1， 任婷婷2， 程明亮1**， 禹萍1

(1.贵州医科大学 感染病学教研室, 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学 生化教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨蓝莓对非酒精性脂肪肝大鼠的保护作用及机制。方法: 40只健康SD大鼠随机均分为正常组、蓝莓组、异甘草酸镁组及模型组，除正常组用普通饲料喂养,其余各组均使用高脂饲料喂养，蓝莓组与异甘草酸镁组在每日固定时间分别灌服蓝莓浆及异甘草酸镁溶液，正常组和模型组灌服等量生理盐水，8周后处死所有大鼠，取肝组织切片油红染色观察各组肝脏脂肪变情况, 采用自动生化仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量；ELISA法检测肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性，Western blot检测大鼠肝组织中醌氧化还原酶1 (Nqo1)的表达。结果: 正常组大鼠肝组织切片油红染色仅见少量分散脂滴, 模型组可见大量红色脂滴, 蓝莓组与异甘草酸镁组脂滴明显少于模型组；与蓝莓组及异甘草酸镁组比较, 模型组大鼠血清ALT、AST、TG、TC及肝组织TNF-α、IL-8含量明显升高(P<0.05)，SOD活性明显降低(P<0.05)；相对于正常组，蓝莓组和异甘草酸镁组Nqo1蛋白的表达明显升高(P<0.05)。结论: 蓝莓对非酒精性脂肪肝大鼠肝损伤有较好的保护的作用, 其机制可能与上调肝组织中Nqo1蛋白的表达有关。

[关键词]蓝莓； 脂肪肝，非酒精性； 醌氧化还原酶1； 肿瘤坏死因子； 白细胞介素-8

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、遗传易感性和代谢紊乱密切相关的氧化应激性肝病，包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)及相关肝硬化和肝癌[1-2]。随着我国生活水平的提高和饮食结构的变化，NAFLD的发病率有逐渐增加的趋势[3]，研究认为氧化应激是NAFLD发病的核心机制[4]。本课题组前期研究已经证实，蓝莓具有减轻NAFLD大鼠氧化应激损伤的作用[5]。本研究以非酒精性脂肪肝模型为对象，探讨蓝莓对非酒精性脂肪肝肝组织Nqo1蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

蓝莓(兔眼品种)由贵州省麻江蓝莓基地提供。异甘草酸镁(天晴甘美,H20051942) ，高脂饲料纯化型(江苏南通特洛菲饲料科技有限公司，TP26300) ，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)检测试剂盒(酶联生物, ml002859)，白介素-8(interleukin8, IL-8)检测试剂盒(酶联生物, ml002885)， 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)蛋白活性检测试剂盒(酶联生物, ml016361)，大鼠还原型辅酶/醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1，Nqo1) 一抗(Abcam公司)，兔抗鼠β-actin多克隆抗体(博士德，BA2305)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(上海基因工程部，GK500710) ，BCA 蛋白含量检测试剂盒(Biomiga，PW0104)。全波长酶标仪(BioTec)，全自动生化分析仪(日本ADVIA2400)，1DYCZ-24DN 型电泳仪(北京六一) ；图像采集系统(OLYMPUS，BX41)。

1.2动物模型建立与分组

雄性SD 大鼠40 只，体质量180～220 g，由贵州医科大学动物实验中心提供[许可证号: SCXK(黔) 2012-0001]，饲养于贵州医科大学动物实验中心。40只SD大鼠适应性饲养1 周后随机分为正常组、蓝莓组、异甘草酸镁组及模型组，每组10 只。除正常组使用正常饲料喂养外，其余各组均用高脂饲料喂养。蓝莓组每日固定时间予蓝莓原浆15 mL/(kg·d)灌胃[5]，异甘草酸镁组予异甘草酸镁溶液15 mL/(kg·d) 灌胃，将原液稀释至1 g/L后，按体表面积计算剂量相当于成人临床推荐剂量；正常组和模型组大鼠予相同量的生理盐水灌胃。各组自由饮食、饮水。8周后处死所有大鼠，处死前禁食禁水12 h，用10%水合氯醛麻醉，股动脉采血，分离血清待用，收集肝脏标本，新鲜肝脏行油红染色，其余肝组织存入-80 ℃待用。

1.3观察指标

取新鲜大鼠肝组织制备病理切片，行油红染色鉴定造模是否成功；全自动生化分析仪测定大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)含量；ELISA法测定肝组织中TNF-α、IL-8含量及SOD 活性； Western blot 检测肝组织Nqo1蛋白表达水平，取40 mg肝组织匀浆后加入细胞裂解液，4 ℃离心提取蛋白，BCA试剂盒行蛋白定量，制浓缩胶、分离胶，蛋白质上样量为80 μg，电泳电压为120 V，2 h后转膜，脱脂奶粉封闭，洗膜后加入Nqo1 抗体(1∶1 500)，4 ℃震荡孵育，过夜后二抗(1∶3 000) 室温孵育1 h，ECL 发光液加入条带上显影，凝胶成像仪扫描，Quantity One 软件分析结果；以β-actin表达水平作为内参，目标蛋白的表达量以目标蛋白与内参蛋白灰度值的对比值表示。

1.4统计学方法

2结果

2.1肝组织脂肪沉积程度

结果显示，正常组大鼠肝组织仅见少量分散脂滴, 模型组可见大量红色脂滴, 蓝莓组与异甘草酸镁组大鼠肝组织中的脂滴明显少于模型组。见图1。

2.2血清ALT、AST、TG及TC水平

模型组ALT、AST、TG及TC均高于正常组(P<0.05)，蓝莓组和异甘草酸镁组各指标低于模型组(P<0.05)，蓝莓组各指标高于异甘草酸镁组(P<0.05)。见表1。

注: A为正常组，B为蓝莓组，C为异甘草酸镁组，D为模型组图1　各组大鼠肝组织(油红，×400)Fig.1　Pathological changes of rat liver in each group detected by oil red O staining

组别n血清ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)正常组1037.25±7.74 75.07±18.60 0.81±0.210.69±0.36蓝莓组10 74.60±9.15(1)(2)(3)152.29±17.51(1)(2)(3)1.68±0.16(1)(2)(3)2.35±0.41(1)(2)(3)异甘草酸镁组1055.42±8.04(2)114.24±17.99(2)1.25±0.24(2)1.51±0.32(2)模型组10 122.17±11.36(1)(3)201.94±20.03(1)(3)2.25±0.26(1)(3)3.24±0.45(1)(3)

(1)与正常组比较,P<0.05;(2)与模型组比较，P<0.05；(3)与异甘草酸镁组比较，P<0.05

2.3肝组织SOD活性、TNF-α及IL-8含量

模型组大鼠肝组织SOD活性显著低于正常组，TNF-α、IL-8含量显著高于正常组(P<0.05)，蓝莓组SOD活性高于模型组，TNF-α、IL-8含量显著低于模型组(P<0.05)。见表2。

2.4肝组织Nqo1表达

模型组大鼠肝组织中Nqo1蛋白水平较正常组高(P>0.05)，蓝莓组和异甘草酸镁组Nqo1蛋白表达量较模型组高(P<0.05)，蓝莓组表达较异甘草酸镁组低(P<0.05)。见图2。

(1)与正常组比较,P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05图2　各组大鼠肝组织Nqo1蛋白表达水平Fig.2　The protein expression levels of Nqo1 in rat liver in each group

3讨论

蓝莓是一种具有很强保健功能食品，具有抗氧化、抗炎症、抗衰老、降血压、降血脂、抗癌、延缓骨质疏松及抗菌等作用[6-7]NAFLD作为一种代谢性肝病，其发病机制与胰岛素抵抗、氧化应激、脂质过氧化、细胞凋亡及以上因素发展所引起的炎症等密

表2　各组大鼠肝组织TNF-α、IL-8及SOD表达

(1)与正常组比较,P<0.05;(2)与模型组比较，P<0.05；(3)与异甘草酸镁组比较，P<0.05

切相关[8]，其中氧化应激机制占有重要地位。Liu等[9]用蓝莓提取物预防性处理肝细胞，随后加入油酸，证明蓝莓可以减轻油酸诱导的肝细胞脂肪变性。本课题组前期研究已经证实，蓝莓所具有的抗氧化活性能够激活沉默信息调节因子1(SIRT1)及其下游细胞因子，发挥抗氧化应激作用；还可以通过上调核因子相关因子2 (Nrf2)的表达，提高肝脏抗氧化能力，从而减轻NAFLD损伤[5,10]。Nqo1是细胞内的重要Ⅱ相代谢酶，该酶能够以NADPH为电子供体，参与包括辅酶q和醌类等多种物质的还原反应,从而与氧化应激引起的细胞损害有关[11]。醌类的还原有利于减少活性氧簇的产生，从而减轻NAFLD状态下的氧化应激损伤。Nqo1的作用受到Nrf2/抗氧化反应元件(ARE)通路的调控[12]。Nrf2/ARE 通路是重要的内源性抗氧化应激通路，其多种下游靶基因都与抗氧化应激和抗炎症反应有关[12-13]。有研究表明， Nqo1的表达水平主要受到 Nrf2的调节[14]。Wang等[15]发现蓝莓可以通过上调Nrf2的表达进而上调Nqo1的表达，从而增强小鼠肝脏的抗氧化能力。除以上所述细胞代谢异常的氧化应激损伤之外，炎症的发展亦可以加重氧化损伤。由于肝细胞的严重脂肪变性和坏死，受损肝细胞和肝巨噬细胞释放出一些炎症因子如TNF-α、IL-8等，进一步引起中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润。这些炎症细胞也释放出O2-、OH及O2等物质[16]，进一步加重细胞膜等结构的损伤，加快疾病的发展。

本实验采用高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪肝模型，对比蓝莓干预后TNF-α和IL-8含量的变化，研究蓝莓在对抗肝脏炎症方面的作用；比较SOD活性和Nqo1蛋白表达量在各组大鼠肝脏变化的情况，探讨蓝莓的抗氧化活性防治NAFLD氧化应激损伤的机制。本研究发现，模型组大鼠肝组织SOD活性显著低于正常组，TNF-α、IL-8含量显著高于正常组。同时免疫印迹法提示肝组织Nqo1表达较正常组升高，但差异并无统计学意义。据此可以推测，在大鼠NAFLD发生过程中，脂肪等物质代谢障碍引起ROS、醌类等氧化活性物质异常积累，SOD等还原性物质大量消耗，使肝细胞发生严重脂肪变性、坏死和凋亡，并进一步引起肝脏炎症，炎症的发展又反过来加重了氧化应激损伤，最终导致了NAFLD的发生。蓝莓组大鼠血清ALT、AST、TG及TC水平显著低于模型组， SOD活性显著高于模型组，TNF-α、IL-8含量显著低于模型组，病理组织学检查发现其肝细胞脂质沉积显著减轻，与异甘草酸镁组接近；表明蓝莓可改善肝功能，减轻肝脏脂肪变，减少炎症因子的释放，对NAFLD大鼠的肝损伤具有减轻作用。蓝莓组Nqo1蛋白表达水平较模型组和正常组高，说明蓝莓具有上调Nqo1蛋白表达，从而促进辅酶Q和醌类物质的转化，减轻肝脏氧化应激损伤的作用，蓝莓对它的调控方式可能是通过Nrf2/ARE通路进行间接调控。推测蓝莓减轻NAFLD大鼠肝脏损伤的机制，可能与上调Nqo1蛋白表达，同时减轻肝脏炎症有关。

4参考文献

[1] Farrell GC, Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis[J]. Hepatology, 2006(2):99-112.

[2] de Alwis NM, Day CP. Non-alcoholic fatty liver disease: the mist gradually clears[J]. J Hepatol, 2008(1):104-112.

[3] Fan JG, Farrell GC. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China[J]. J Hepatol, 2009(50):204-210.

[4] Nobili V, Donati B, Panera N, et al. A 4-polymorphism riskscore predicts steatohepatitis in children with nonalcoholic fatty liver disease [J].Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2014(5): 632-636.

[5] Ren TT, Huang C, Cheng ML. Dietary blueberry and bifidobacteria attenuate nonalcoholic fatty liver disease in rats by affecting SIRT1-mediated signaling pathway[J]. Oxid Med Cell Longev, 2014(2014): 469059.

[6] 刘欢．“浆果之王”蓝莓的营养保健作用研究[J]．中国新技术新产品, 2009(19):228-229.

[7] 陈介甫,李亚东,徐哲.蓝莓的主要化学成分及生物活性[J].药学学报, 2010(4): 422-429.

[8] Medina J, Femadez-Salazar Li, Gareia B, et al. Approach to the Pathogenesis and treatment of non alcoholics teato-hepatitis[J].Diabetes Care, 2004(27):2057-2059.

[9] Liu YL, Wang D, Zhang D,et al. Inhibitory effect of blueberry polyphenolic compounds on oleic acid-induced hepatic steatosis in vitro[J]. J Agric Food Chem, 2011 (22):12254-12263.

[10]黄超,任婷婷,王豫萍,等.蓝莓对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝细胞核因子相关因子2 表达的影响[J].中西医结合肝病杂志, 2015(1):39-41.

[11]Enomoto A, Itoh K, Nagayoshi E, et al. High sensitivity of Nrf2 knockout mice to acetaminophen hepatotoxicity associated with decreased expression of ARE-regulated drug metabolizing enzymes and antioxidant genes[J].Toxicol Sci, 2001(1):169-177.

[12]Keum YS，Choi BY. Molecular and chemical regulation of the Keap1-Nrf2 signaling pathway[J]. Molecules, 2014(7):10074-10089.

[13]Saw CL, Guo Y, Yang AY, et al. The berry constituents quercetin, kaempferol，and pterostilbene synergistically attenuate reactive oxygen species: involvement of the Nrf2-ARE signaling pathway[J].Food Chem Toxicol, 2014(72):303-311.

[14]Itoh K, Chiba T, Takahashi S, et al.An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase Ⅱdetoxifying enzyme genes through antioxidant response elements[J].Biochem Biophys Res commum, 1997(2):313-322.

[15 Wang YP, Cheng ML, Zhang BF, et al. Effect of blueberry on hepatic and immunological functions in mice[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2010(9):164-168.

[16]MacNee W. Oxidative stress and lung inflammation in airway disease[J]. Eur J Pharmacol, 2001(1): 195-207.

(2015-12-05收稿，2016-02-10修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Effect of Blueberry Compound on Hepatocyte Expression of Nqo1 in Rats Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease

ZHAO Danbo1， REN Tingting2， CHENG Mingliang1， YU Ping1

(1.DepartmentofInfectiousDiseases,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protection effect of blueberry on rats with non-alcoholic fatty liver disease and its mechanism. Methods: Forty healthy SD rats were randomly divided into normal control group, blueberry group, magnesium isoglycyrrhizinate group and model group. The rats in normal control group were given normal diet, while other groups were all given high fat diet. Blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group were given blueberry juice by intragastric administration while normal group and model group were given equivalent volume of physiological saline by intragastric administration at the same time per day．At the end of 8(th) week, all rats were sacrificed. Pathological changes in the hepatic tissue were observed by Oil-Red staining. The contents of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in serum were detected by automatic biochemical analyzer. The contents of TNF-α, IL-8 and SOD activity in hepatic tissue were detected by ELISA. The expression of Nqo1 in liver tissue was detected by Western blot. Results: The Oil-Red staining result showed that only a little dispersed lipid droplet could be seen in normal group, blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group while a lot of dispersed lipid droplet in model group. Compared with blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group, the contents of serum ALT, AST, TG and TC increased significantly, and the contents of TNF-α and IL-8 in heptic tissue inceased significantly (P<0.05) while SOD activity decreased significantly (P<0.05). Compared with normal group, the protein expression levels of Nqo1 in blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group increased significantly (P<0.05). Conclusion: Blueberry can play a protective role in liver injury of non-alcoholic fatty liver of rats and the mechanism might be associated with upregulating the expression of Nqo1 in hepatic tissue.

[Key words]blueberry; fatty liver，non-alcoholic; quinone oxidoreductase 1; tumor necrosis factor; interleukin-8

[中图分类号]R363.1； R575.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)03-0276-04

*[基金项目]教育部博士点经费基金资助项目(No. M2012-59)

**通信作者 E-mail:mlcheng@yeah.com

网络出版时间：2016-03-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1054.044.html