贵阳腐霉灭蚊能力持效性研究*

杨　虓， 王艳辉， 苏晓庆,3**

(1.珠海盈嘉行科技有限公司， 广东 珠海　519000； 2.宜昌安瑞普生物科技公司， 湖北 宜昌　443000； 3.贵州医科大学 生物学教研室， 贵州 贵阳　55004)



·专题研究·

贵阳腐霉灭蚊能力持效性研究*

杨虓1， 王艳辉2， 苏晓庆1,3**

(1.珠海盈嘉行科技有限公司， 广东 珠海519000； 2.宜昌安瑞普生物科技公司， 湖北 宜昌443000； 3.贵州医科大学 生物学教研室， 贵州 贵阳55004)

[摘要]目的： 研究贵阳腐霉灭蚊能力的持效性。方法： (1)用贵阳腐霉菌丝体连续感染2批蚊幼虫，观察2批蚊幼虫的死亡率及感染率，计算感染率；(2)采用室外人工模拟法，设立对照组、贵阳腐霉组、贵阳腐霉加Bti组、贵阳腐霉加真菌D组、和贵阳腐霉加Bti和真菌D组，加入贵阳腐霉后第111天和273天分别加入2～3龄蚊幼虫(哨位蚊)48 h后取出，观察蚊幼虫死亡情况及感染率；(3)于菜地蓄水池中投入贵阳腐霉菌丝体悬液，并于投入前及投入后第5、15、30、57及122天记录蚊幼虫数，观察感染情况；(4)在Bti致死的蚊幼虫中加入贵阳腐霉菌，观察贵阳腐霉的腐生情况。结果： (1)3株贵阳腐霉的感染力有不同，但是在第2批实验中蚊虫的校正感染率、单碗最高感染率和单碗最低感染率均明显高于第1批(P<0.05)；(2)在室外模拟水体实验中，纯贵阳腐霉组及其他含贵阳腐霉组第111天哨位蚊全部死亡，对照组蚊虫无死亡；第273天仅纯贵阳腐霉组的哨位蚊死亡，显微镜下观察死亡虫体均布满贵阳腐霉菌丝；(3)菜地蓄水池实验结果显示，投放贵阳腐霉菌丝体第5天蚊虫密度较投放前明显减少，投放第15天时偶见蚊幼虫，投放第30及57天时基本上看不见蚊幼虫，第122天见大量死蚊，显微镜下观察蚊体有真菌感染；(4)腐生实验发现被Bti杀死的蚊幼虫尸体长满贵阳腐霉的菌丝，产生大量孢子囊，并释放游动孢子。结论： 贵阳腐霉在水体中可长期制约蚊虫, 持效期最长达273 d。

[关键词]贵阳腐霉； 真菌； 生物灭蚊； 持效，长效制剂

近年来蚊媒病的流行，使蚊虫的防治再次提上日程[1]。目前大多采用化学杀虫剂控制蚊虫，这不仅会导致环境污染，更严重的是还会诱导蚊虫产生抗药性，进一步增加防蚊工作中人力物力的浪费[2-5]。蚊虫生物防治是对环境无害的一种手段，已经成为目前研究的热点之一。贵阳腐霉是一种有开发应用前景的灭蚊真菌，自从1994年从土壤中获得该菌以来，已对其进行了大量的研究，包括生物学和生态学特性、对环境的安全性及其灭蚊能力等方面[6]。因贵阳腐霉是兼性寄生真菌，既可以营寄生生活，又可以营腐生生活，并可以在水环境中定植。那么它的这一特性是否能够使它对蚊虫的控制有比较长的持效期呢，本文对此进行观察和研究。

1材料与方法

1.1菌种和蚊虫

研究所用贵阳腐霉为本实验室保种，在SFE培养基中传代，每月进行一次虫体复壮(制成含贵阳腐霉菌丝体的琼脂块)；所用灭蚊细菌为5日菌龄的苏云金杆菌以色列变种(Bacillus thuringiensis var. israelensis，Bti)；所用致倦库蚊为本实验室驯化并培养的2～3日龄幼虫，养蚊室温度(25±1)℃，湿度70%，光周期L∶D=14∶10。模拟室外灭蚊实验采用另一灭蚊真菌(代号D)与贵阳腐霉进行对比实验。

1.2方法

1.2.1室内生物测定取耐高温塑料碗8只，高压灭菌后，每碗盛200 mL过夜自来水，加25只致倦库蚊幼虫、4%鸡肝粉悬液8滴，均分为实验组和对照组，实验组加入带菌丝的琼脂块(面积约为113 m2)3块，对照组每碗加入3块空白SFE琼脂块。每天观察2次，取出死蚊，显微镜下观察感染情况。记录蚊虫死亡数和感染数，计算总感染率和单碗感染率，感染率=(感染数/蚊虫总只数)×100%。共测试3个菌株。第1批蚊虫死亡或化蛹后全部取出，并加入第2批蚊幼(25只)，同样方法继续观察，计算第2批蚊幼虫的感染率。

1.2.2模拟室外灭蚊实验采用室外人工模拟法，取塑料小桶盛自来水4 L，加入灭菌泥土50 g，灭菌木屑8 g。设立纯贵阳腐霉组(加入含贵阳腐霉菌丝体约63.6 cm2的琼脂块)、贵阳腐霉加Bti组(加入含贵阳腐霉菌丝体约63.6 cm2的琼脂块及5日菌龄Bti悬液1 mL)、贵阳腐霉加真菌D组(加入含贵阳腐霉菌丝体约63.6 cm2的琼脂块及真菌D)、贵阳腐霉加Bti加真菌D组及对照组(仅加琼脂块)。不定期向各组桶内加入致倦库蚊卵块。每桶内设尼龙网兜，加入贵阳腐霉后第111天和273天加入2～3龄蚊幼虫(哨位蚊)，于加入蚊幼虫48 h观察蚊幼虫感染率及死亡情况。

1.2.3田间观察选取湖北宜昌菜地蓄水池90 m2,一次性投放液体培养菌丝体200 g(湿重)，于投放菌丝前、投放菌丝后第5、15、30、57及122天，取5勺水，记录幼虫只数，取平均值计算蚊虫密度，对死蚊进行显微镜下观察。

1.2.4贵阳腐霉的腐生生长取致倦库蚊3日龄幼虫，先用Bti致死，再加入贵阳腐霉，48 h后取蚊虫镜检，同时取贵阳腐霉对蚊虫进行生物测定的水体中的有机物块镜检，观察贵阳腐霉的腐生生长情况。

1.3统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，记数资料采用率(%)表示，数据比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1室内生物测定

表1结果显示，3株贵阳腐霉的感染力有不同，在第2批实验中蚊虫的校正感染率、单碗最高感染率和单碗最低感染率明显高于第1批(P<0.05)。

2.2模拟室外灭蚊结果

加入贵阳腐霉后第111天时加入哨位蚊，对照组蚊虫无死亡，而纯贵阳腐霉组、贵阳腐霉加Bti组、贵阳腐霉加真菌D组、贵阳腐霉加Bti加真菌D组，收回的蚊虫全部死亡，显微镜下虫体布满贵阳腐霉菌丝。加入贵阳腐霉后第273天加入哨位蚊，对照组蚊虫无死亡，纯贵阳腐霉组哨位蚊全部死亡，显微镜下虫体布满贵阳腐霉菌丝体；但含贵阳腐霉其他组的哨位蚊没有死亡。

表1　三株贵阳腐霉连续感染蚊虫实验

(1)与第1批同菌株比较，P<0.05

2.3田间灭蚊效果观察

投放贵阳腐霉液体培养菌丝体第5天蚊虫密度明显比投放前减少，投放第15天偶见蚊虫，投放第30、57天都没有发现蚊虫。当时是当地蚊虫高发期，附近未投药水体蚊虫密度达32只/300 mL或以上。投放的第122天，当时当地经历7天36 ℃高温，然后经历暴雨过后观察，水面有大量2龄幼虫，取样显微镜下观察，约80%为死蚊，其中60%蚊体发现真菌感染；表明贵阳腐霉控制蚊虫的持效期可达4个月，并在高温酷夏之后仍有明显效果。(见表2)

表2　田间实验灭蚊结果

(1)周边水体观察蚊虫密度达32只/300 mL；(2)经过7 d36 ℃高温，再经暴雨后

2.4贵阳腐霉的腐生生长

被Bti杀死的蚊幼虫尸体长满贵阳腐霉的菌丝，产生大量孢子囊，并释放游动孢子。在贵阳腐霉对蚊虫进行生物测定的水体中取出的木屑、蚊虫饲料颗粒上有大量贵阳腐霉菌丝，见图1。

3讨论

在与蚊虫的斗争中，灭蚊剂的持效期是一个非常重要的问题。特别在大面积灭蚊的情况下，根据课题组经验每月用药一次比每月用药三次要节约2/3的药剂和人工费。在生物灭蚊剂中， Bti的灭蚊效果好，价格便宜，但是持效期一般仅为7 d。其他灭蚊剂，包括化学杀虫剂(双硫磷、倍硫磷、安倍等)和生物灭蚊剂(球形芽孢杆菌)持效期比较长，但是价格都是Bti的几倍甚至十几倍。贵阳腐霉具有对环境友好，生产成本低的优点，如果它有较长的持效期将有利于蚊虫生物防治的推广。因此贵阳腐霉的持效期是本课题的研究要点。

在实验室小型生物测定中，第2批蚊虫的感染率都比第1批蚊虫的感染率高，原因可能是贵阳腐霉是活的(这与其他灭蚊细菌不同)，在前面一轮灭蚊中它通过蚊尸繁殖，因此水体中积累了更多的贵阳腐霉菌丝体和游动孢子，从而提高了贵阳腐霉的感染率。

在室外人工模拟水体中长期观察中，结果提示贵阳腐霉在加入蚊虫孳生水体111 d后，仍然存活，并保持比较强的灭蚊毒力；在加入水体273 d后虽然仅一桶里有贵阳腐霉存在并发挥灭蚊作用。但273 d代表了所观察到的贵阳腐霉持效的最长时间。在田间实验中也得到122 d以后贵阳腐霉还能控制蚊虫的记录。说明在有蚊幼虫存在时，贵阳腐霉行寄生生活，侵入蚊虫体内，分解其器官化为自己的营养，进行生长繁殖。当水体中蚊虫稀少时，它可以在水体中的有机物，甚至是植物的碎片上或蚊尸行腐生生活。因蚊尸可以为贵阳腐霉提供高质量的营养物质，有利于提高其毒力，所以，贵阳腐霉可以在水体中定植，长期生存，成为环境中长期控制蚊虫的重要因素。贵阳腐霉的这个特点非常适合用于蚊虫的生态系统控制。即在蚊虫孳生的生态环境中加入贵阳腐霉，伴以其他的控蚊因素(例如天敌等)共同降低蚊虫的环境容纳量，使它的种群密度不会超过能引起危害的限度，达到一劳永逸的效果。

当然，实际现实中各种情况均可能发生。若生态系统的平衡被某因素打破，造成蚊虫种群爆发，这时必须采用其他手段包括化学杀虫剂，迅速扑灭虫情。针对不同情况，采用不同的治蚊手段，这也就是基于生态学原理的多学科手段有机结合的蚊虫综合治理方法(IPM)[7-8]。

4参考文献

[1]孟凤霞，王义冠，冯磊.等.我国登革热疫情防控与媒介伊蚊的综合治理 [J].中国媒介生物学及控制杂志, 2015(1)：4-10.

[2]冠景轩，刘宏美，公茂庆,等.山东省白纹伊蚊对常用化学杀虫剂的抗性调查 [J]. 寄生虫病与感染性疾病, 2015(13)：115-117.

[3]陈志龙，陈东亚，刘慧,等.淡色库蚊幼虫对7种杀虫剂的敏感性和抗性调查 [J]. 中华卫生杀虫药械, 2011(3)：209-211.

[4]代玉华，程鹏，刘丽娟,等.山东部分地区中华按蚊的抗药性监测 [J].中国媒介生物学及控制杂志, 2014(3)：219-221.

[5]裴速建，张华勋，李凯杰,等.湖北省中华按蚊对溴氰菊酯的抗药性监测 [J].中国媒介生物学及控制杂志, 2014(1)：18-20.

[6]苏晓庆，刘萍，张传博，等.灭蚊真菌贵阳腐霉及其研究进展 [J].中华卫生杀虫药械, 2010(2)：141-144.

[7]Richard C. Axtell Principles of integrated pest management (IPM) in relation of mosquito control [J] . Mosquito News, 1979 (4): 709-718.

[8]陆宝麟.蚊虫综合治理[J].昆虫学报， 1978(2)：217-232.

(2015-12-20收稿，2016-02-28修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

A Study on Persistence ofPythiumguiyangensein Mosquito Breeding Environment

YANG Xiao1, WANG Yanhui2, SU Xiaoqing1,3

(1.YingjiahangS.T.Co.LTD,Zhuhai519060,Guangdong,China; 2.YichanganruipuBiologySicience&TechnologyCompanyLTD,Yichang443000,Hubei,China; 3.DepartmentofBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the persistence of virulence of Pythium guiyangense (Pg). Methods: (1) Using the fungal mycelia to infect 2 batches of mosquito larvae consecutively, and to compare their mortality rates and infection rates; (2) using sentinel mosquitoes to monitor the fungal virulence to mosquito larvae in long-term in out door artificial water containers, which were divided into groups of control (C), Pg (P), Pg plus Bti (PB),Pg plus fungus D (PD), and Pg plus Bti and fungus D (PBD). Sentinel mosquitoes were put in containers on the 111(st) and 273(rd) days after microbe application, and were taken into the lab in 48h later. The mortality rates and infection rates of these mosquitoes were used to show the situation of Pg;(3) Field trail: suspension of Pg mycelia was applied in a vegetable field water reservoir,and the mosquito density inside was observed before and 5, 15. 30. 57 and 122 days after the application was observed and compared. (4)Observing saprophytic growth of Pg: residue in Pg bioassay containers and mosquitoes that killed by Bti and then incubated with Pg were observed with microscope for Pg mycelia. Results: (1) In lab continuous test with 3 strains of Pg, all the adjusted infection rates in groups, highest and lowest infection rates in individual containers of the second batch of mosquitoes were higher than those of the first batch. (2) In outdoor artificial water body test, the sentinel mosquitoes from groups P, PB, PD, and PBD of the 111(st) day all died and infected with Pg while no sentinel mosquito from group C died. For the sentinel mosquitoes on the 273(rd) day, all the sentinel mosquitoes from group P died and infected with Pg, although no mosquito from other groups died. (3)Field trial showed that mosquito density in 5 days after the application of Pg was significantly lower than that before, and the density dropped sharply thereafter. No larvae was found on the 30(th) and 57(th) days. The latest day of observation was the 122(ed) day of application when about 80% mosquito larvae died, of which 60% were found infected by Pg. (4)Pg mycelia were found from mosquito corpses and organic matter from Pg bioassay containers. Conclusions: Pg can control mosquito larvae in mosquito breeding water for long duration. The observed longest persistence was 273 days in our studies.

[Key words]Pythium guiyangense; fungus; mosquito biological control; long-acting formula

[中图分类号]R184.31; R379;Q939.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)03-0254-04

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No：30760140)

**通信作者 E-mail:su.xiaoqing@aliyun.com

网络出版时间：2016-03-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1012.010.html