急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的检验分析

杨　莉，何浩明

(1.沭阳县人民医院检验科，江苏宿迁 223600；2.连云港市第一人民医院检验科，江苏连云港 222002)



·临床研究·

急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的检验分析

杨莉1，何浩明2

(1.沭阳县人民医院检验科，江苏宿迁 223600；2.连云港市第一人民医院检验科，江苏连云港 222002)

摘要:目的应用流式细胞学技术检测急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的变化分析，揭示急性髓细胞白血病中外周血淋巴细胞亚群的变化规律，为临床个体化治疗累积分子机制研究资料。方法应用流式细胞学技术检测80例急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞，应用相应的单克隆抗体检测CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值及CD16+/CD56+NK细胞百分比。同时通过CD45/SSC设门分析，分别测定多种CD分子的表达率，并通过配对检验分析不同高表达CD分子相关性。结果急性髓细胞白血病(AML)组患者CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值及CD16+/CD56+NK细胞百分比显著低于健康对照组，CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64阳性表达不仅比例高，而且表达量高。配对分析表明CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表达有差异性。结论AML患者免疫系统低下，外周血CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO的表达高。

关键词:急性髓细胞白血病；淋巴细胞亚型；CD抗原

急性髓细胞白血病(AML)也称为急性非淋巴细胞白血病(ANLL)，是一种血细胞的髓性癌积聚在骨髓中生长快速的异常白细胞干扰正常血细胞的生成，进而从骨髓进入血液取代正常血细胞，是高度异质化的恶性血液病。AML疾病的进展十分迅速，患者如若诊断不及时或未接受治疗通常几周或几个月的时间就可能丢失生命[1]。AML的具体病因至今并不明确，病毒感染、遗传因素、化学物质毒性等都可能与AML的发病有关，而机体细胞/体液免疫功能缺失，免疫监视和免疫清除能力减弱，可能会导致癌细胞无限增殖[2-3]。因此通过检测AML患者外周血淋巴细胞亚群分析，可判断患者机体免疫功能状态和细胞免疫系统重建的情况，采取相应的措施预防感染。

1资料与方法

1.1一般资料收集2011年6月至2015年6月江苏省沭阳县人民医院收治的80例AML患者的标本，根据临床血常规和骨髓穿刺检查确诊，符合张之南的《血液病诊断及疗效标准》[4]。80例患者(AML组)中男45例，女35例；年龄4～62岁，中位年龄19岁；根据FAB分型划分为M0 2例，M1 10例，M2 26例，M3 21例，M4 6例，M5 8例，M6 7例。选取同期健康者80例(健康对照组)，其中男48例，女32例，年龄16～54岁、中位年龄22岁。两组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2试剂和仪器MultiSET免洗淋巴细胞亚群试剂盒，红细胞裂解液，以及CD4、CD8、CD56、CD16、CD19、CD7、CD2和CD64等单克隆抗体购自美国BD公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3方法采取外周静脉全血2 mL置于抗凝管中振摇均匀后备用。分别取50 μL抗凝全血置于FACS专用试管中，各加入20 μL CD3/CD4/CD8/CD45/CD19/CD45/CD1等标记的抗体，漩涡混匀，室温避光放置15 min后，加入450 μL溶血素，混匀后避光放置15 min，通过流式细胞仪CD45/SSC设门对10 000个细胞进行检测，通过FACS Diva软件分析细胞的免疫表型和表达强度。

2结果

2.1淋巴细胞亚群检测结果AML组与健康对照组比较，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+均明显低于健康对照组(P<0.05)；CD19+B淋巴细胞百分比AML组明显高于健康对照组(P<0.05)；而AML组CD16+/CD56+NK细胞百分比明显低于健康对照组(P<0.05)。见表1。

2.2不同CD分子在AML患者中的表达80例AML患者中CD抗原表达各不相同，其中以Cyt-MPO、CD38、CD33和CD64表达率较高(表2)，将表达百分比超过60.0%作为高表达患者，则Cyt-MPO(68.8%)、CD38(71.2%)、CD64(32.5%)和CD33(73.8%)为高阳性表达，提示这些CD分子在AML诊断上可能有直接诊断价值。

表1　　AML患者及健康对照组外周血T、B淋巴细胞和NK细胞亚群检测结果±s)

*1:P<0.05,与健康对照组相比。

表2　　80例AML患者CD抗原表达分布[n=80，n(%)]

2.3高表达CD33与CD15、CD64和Cyt-MPO在AML患者体内表达的相关性由表2的数据可以发现CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO在AML患者中的表达程度较高(将表达率超过60.0%定义为阳性)，分别进行CD33与CD15、CD64及Cyt-MPO的两两比较，经检验CD33与CD15、Cyt-MPO的抗原表达差异有统计学意义(P<0.05)，CD33与CD64之间的抗原表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　　高表达CD33与CD15、CD64和Cyt-MPO在

3讨论

AML是造血干细胞异常增生的恶性肿瘤性疾病，虽然白血病的治疗已经取得了很大的进展，但是目前AML患者的5年生存率依然较低[5]。主要是目前的治疗手段不能够彻底清除致病细胞，使得致病细胞有一定的残留，从而引起白血病复发，这是导致白血病致死的关键因素[6-7]。

临床很多研究资料的结果表明，白血病患者外周血淋巴细胞亚群异常与白血病的发病具有较为密切的相关性。淋巴细胞是构成免疫系统的主要细胞，根据细胞的表面标志与功能，可将淋巴细胞分成许多不同的群体，在免疫应答过程中经抗原活化后进行分化和增殖，最后表达功能行使效应，维持机体内环境的稳定。T淋巴细胞在肿瘤免疫中起中心调控作用。T细胞亚群是一群具有特殊标志的人胸腺中输出细胞，执行细胞免疫功能及免疫调节功能；其中 CD3+细胞代表 T 淋巴细胞总数；CD4+细胞为免疫应答中的主要反应细胞，具有增强和扩大其他免疫细胞的功能；CD8+细胞可对靶细胞产生细胞介导的细胞毒作用，同时对 CD4+细胞具有调节性免疫抑制作用；CD4+/CD8+的稳定比例维持着细胞免疫反应的平衡，只有在 CD4+/CD8+正常时才能发挥抗肿瘤作用。CD4+T淋巴细胞的减少表明患者体内细胞免疫功能下降；CD8+T淋巴细胞的相对增加使得机体处于免疫抑制状态，减弱白细胞清除癌变细胞的能力，使癌变细胞残存，导致复发率上升。CD19是B细胞的标志之一，与B细胞的分化、活化、增殖以及抗体产生有关。由于CD45是白细胞表面的共同抗原，通过CD45/SSC设门可以得到几乎没有杂细胞的全部白细胞。CD33分子是髓系细胞细胞表面的跨膜受体，通常被认为是粒细胞特异性的标志[8]。CD64分布于白细胞表面，是Fc受体之一，属于免疫球蛋白超家族的成员，是连接体液调节和细胞免疫的桥梁作用[9]。Cyt-MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，可以通过催化氯化物和过氧化氢的氧化产生足够的自由基，抑制NK细胞对肿瘤细胞的反应，可以直接影响机体的免疫功能[10]。CD15是一种存在于中性粒细胞和单核细胞细胞膜表面糖蛋白的一种碳水化合物抗原。CD15不仅作为第二信使参与细胞间的信号传导，将细胞外信息传导至细胞质和细胞核，而且还通过细胞黏附作用，使肿瘤细胞易于黏附在基膜上，促进癌症的进展。

本文对AML患者和健康人的外周血淋巴细胞相关指标进行检测，结果显示，AML患者的CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值均明显低于健康人，CD8+T淋巴细胞高于健康人，说明AML患者体内的免疫功能紊乱。结果还显示AML患者体内的CD19水平明显高于健康人，其原因可能是由于CD4+、CD3+T淋巴细胞的下降以及CD4+/CD8+比值的降低可以刺激B淋巴细胞增生，造成体液免疫功能亢进而导致的[7]。CD16+/CD56+是NK细胞的标志物，其表达量可能与NK细胞的功能有关。NK细胞是机体防御的天然平展，可直接杀伤肿瘤细胞或使其活性降低抑制肿瘤的发展和转移。AML患者NK细胞百分比显著降低，说明初发AML患者NK细胞功能低下，机体免疫能力下降。

本研究进一步检测了多种CD分子，结果表明不同CD分子在同一个体的表达差异较大。CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64阳性表达不仅比例高，而且表达量高，具有足够的稳定性，在AML的诊断中有着重要的意义。本研究通过配对检验分别比对CD33/CD15、CD33/CD64和CD33/MPO高表达的构成差异，结果显示CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表达有差异性，差异有统计学意义(P<0.05)，表明两者联合检验会提高AML的诊断率。

综上所述，AML患者免疫功能低下，CD3+、CD4+T淋巴细胞和NK细胞的表达显著降低，在多种CD分子的检测中，同一个对不同CD分子的表达也不相同。CD13、CD33、Cyt-MPO和CD64在AML中有着更高的阳性表达率。随着嵌合抗原受体T细胞、NK细胞治疗技术的发展，靶向性更强的治疗手段会为彻底治愈AML提供思路。

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(收稿日期：2016-01-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.045

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0817-03