iPSC外泌体载体肺血管内皮细胞及肺泡Ⅱ型上皮细胞摄入研究

鞠志海，王 晨，马金辉，于 洁，乔叶薷，黑飞龙



iPSC外泌体载体肺血管内皮细胞及肺泡Ⅱ型上皮细胞摄入研究

鞠志海，王 晨，马金辉，于 洁，乔叶薷，黑飞龙

［摘要］：目的 全身炎症反应在体外循环致肺损伤过程中起关键作用。外泌体载体能否被肺脏靶细胞有效摄入是急性肺损伤(ALI)基因治疗的关键。方法 超速离心法提取体外培养的iPS细胞外泌体,Western Blot鉴定其特征蛋白表达。PKH26标记的外泌体与肺微血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞体外共培养,免疫荧光共聚焦技术检测靶细胞对外泌体的吸收、摄取情况。结果 iPS细胞来源的外泌体可以被肺微血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞有效摄入。结论 iPS细胞外泌体可以被肺脏靶细胞有效摄入,是ALI基因治疗的理想载体。

［关键词］：急性肺损伤；iPS细胞；外泌体；载体；摄入

Study on uptake of exosomes derived from iPSC in pulmonary microvascular endothelial cells and typeⅡalveolar epithelial cells

Ju Zhi-hai,Wang Chen,Ma Jin-hui,Yu Jie,Qiao Ye-ru,Hei Fei-long
Department of Cardiopulmonary Bypass,Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,National Center for Cardiovascular Diseases,Beijing 100037,China
Corresponding author:Hei Fei-long,Email:heifeilong@ 126.com

［Abstract］：Objective Systemic inflammatory response plays a vital role in lung injury caused by CPB.The success of gene therapy toward to ALI is mainly depended on whether an exosome vehicles could be absorbed by the target cells in lung.Methods Exosomes were isolated from iPS cells(iPS-Exo) derived from renal tubular epithelial cells using ultracentrifugation and characterized by western blotting and then labeled with PKH26 and cocultured with pulmonary microvascular endothelial cells(PMVECs) or typeⅡalveolar epithelial cells(A549),Using laser scanning confocal microscopy to decide the uptake of these exosomes.Results iPS-Exo could be absorbed by both PMVECs and A549 in vitro.Conclusion The iPS-Exo may be considered as an ideal carrier since they could be delivered to the target cells in lung successfully.

［Key words］： Acute lung injury；iPS cell；Exosomes；Carrier；Uptake

体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)手术期间,肺是受损最为常见和损伤严重的器官之一,重者可表现为急性肺损伤(acute lung injury,ALI)[1]。肺损伤机制目前尚未明了,学者研究认为全身炎症反应在CPB肺损伤过程中发挥重要作用[2],特别是NLRP3(nucleotide-binding-domain,leucine-rich repeat domain containing protein 3,NLRP3)炎性小体对ALI炎性调控作用十分关键[3-4]。siRNA( small interfering RNA)沉默NLRP3炎性小体可有效控制炎症反应,减轻组织损伤[5]。iPS细胞外泌体(exosomes)是非常理想的siRNA载体,其能否被肺脏的靶细胞高效吸收和摄取成为ALI精准基因治疗的关键。

1 试剂与方法

1.1 主要试剂 iPS细胞由本课题组前期研究获得[6],肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549购自ATCC),PSCeasy多潜能干细胞培养基(赛贝生物),肺微血管内皮细胞及ECM培养基(Sciencell),PKH26(Mini 26,Sigma),Phalloidin-FITC(P5282,Sigma),FITCWGA(ab20528,Abcam),抗CD63抗体(ab59479,Abcam),抗TSG101抗体(ab83,Abcam)。

1.2 材料与设备 超速离心管(Beckman)、Optima L-100XP超速离心机(Beckman)、Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜(Germany)。

1.3 实验方法

1.3.1 iPS细胞培养及条件培养基收集 将iPS细胞复苏至Matrigel包被过的培养皿中,37oC、5%CO2孵箱孵育,定时换液,待细胞汇合度达70%时弃旧培养基加入新鲜培养基培养48 h,收集细胞培养上清,1 000 g离心10 min,取上清备用。

1.3.2 iPS细胞外泌体提取 将上清以300 g,10 min离心一次；2000 g,10 min一次；10 000 g,30min一次；100 000 g,70 min,弃上清。PBS洗涤,100 000 g离心70 min,所得外泌体以100 μl PBS重悬-80oC保存备用。

1.3.3 外泌体PKH26染色 100 μl外泌体悬液加入PKH26染色工作液,吹打混匀,室温孵育5 min,不时摇匀,血清终止染色,室温固定1 min,加PBS至终体积7 ml,配平后120 000 g离心70 min,弃上清使管中剩余100 μl液体中重新加PBS至7 ml,120 000 g离心70 min,弃上清,500 μl完全培养基重悬外泌体,向培养有微血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞的3.5 cm共聚焦培养皿中各加入100 μl外泌体,37oC、5%CO2孵箱孵育4 h。

1.3.4 免疫荧光 吸走细胞培养基,PBS洗涤两次,4%PFA室温固定。PBS洗涤一次,0.1%Triton通透工作液室温通透10 min。吸走Triton通透工作液,5%BSA室温封闭60 min。加一抗,2～8oC孵育过夜。PBS洗涤后,DAPI封片染核,室温避光孵育5 min,激光共聚焦显微镜下观察成像。

1.3.5 Western Blot 恒压120 V电泳90 min；转膜；封闭；加一抗:抗CD63(1∶1 000)或抗TSG101(1∶1 000),4℃摇床过夜；TBST洗膜；加二抗室温孵育1 h；TBST洗膜；显色。

2 结 果

2.1 iPS细胞多能性标记物鉴定 iPS细胞标志物染色显示见图1。

2.2 iPS细胞外泌体特征蛋白表达情况 外泌体特征蛋白表达见图2。

2.3 肺微血管内皮细胞（PMVECs）摄入iPS外泌体

图3的左侧图显示正常状态下PMVECs呈典型的铺路石样排列；右侧图显示PMVECs可以有效的摄入iPS外泌体。

2.4 肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549）摄入iPS外泌体图4显示PKH26标记的iPS细胞外泌体可以被A549细胞有效摄入。

图1　上列自左向右依次为:Oct4、Sox2、TRA-1-60下列自左至右依次为:SSEA4、TRA-1-81、Nanog

图2　Western Blot结果显示外泌体特征蛋白TSG101(46 kDa)、CD63(26 kDa)

图3　PMVECs(左)；免疫荧光(右),蓝色:DAPI染核；绿色:WGA标记胞浆；红色:PKH26标记外泌体

图4　肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)免疫荧光,DAPI染核为蓝色；Phalloidin标记细胞actin为绿色；PKH26标记外泌体为红色

3 讨 论

CPB手术期间,肺是最常见的受损器官之一,研究认为全身炎症反应在CPB肺损伤过程中发挥重要作用。特别是炎症反应的质量失衡在ALI的发病机制中发挥关键作用[7]。CPB应激刺激、缺血-再灌注损伤等因素通过非特异性免疫模式识别受体激活NLRP3/ASC/Pro-caspase-1炎性复合体,Caspase-1水解、切割IL-1β和IL-18前体,使其转化为有活性的成熟体。一方面增加肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的通透性；另一方面促进更多炎性细胞因子产生释放,引发炎性级联反应进一步加重肺损伤[7,8]。

虽然ALI相关的病理生理机制目前已经较为清楚,但仍缺乏有效的治疗措施,目前的治疗手段均存在一定的缺陷。长时间机械通气可加重肺损伤；液体限制则可能导致不同程度的肾损伤；皮质激素可产生神经肌病[9]。如能采用基因治疗手段对炎性反应调控通路的上游环节进行干预,则可有效的控制炎症反应发生的程度和规模,使CPB引致的肺损伤得到有效控制。

NLRP3炎性小体在炎症反应调控中发挥十分关键的作用。siRNA等药物沉默或抑制NLRP3炎性小体可有效控制炎症反应,减轻组织损伤[5,10-11]。外泌体是生物体内的一种纳米级囊泡结构,作为纳米级药物载体被广泛研究[12-15],而获取组织相容性好、无免疫原性的外泌体是递送siRNA的关键。iPSc不存在伦理问题,细胞扩增容易,无免疫排斥,可大量获取,是十分理想的外泌体供体细胞类型,但其能否被肺脏靶细胞高效吸收和摄取成为ALI基因治疗的关键。

血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞是构成肺泡气血屏障的两种主要细胞,是siRNA作用的关键靶细胞。抑制肺组织的炎症反应,减轻肺损伤可以维持肺泡气血屏障的正常功能,缓解ALI。本研究采用Thery等[17]报道的标准外泌体提取流程从iPS细胞培养基中分离、提取的外泌体均能表达外泌体特征蛋白CD63和TSG101,说明从iPS细胞获取外泌体是可行的。iPS细胞可以体外大量增殖,这就为外泌体的大量获取提供了保证,也为下一步siRNA的装载做好了准备。外泌体能否穿梭进入肺脏的靶细胞是siRNA基因治疗的另一关键。本研究采用免疫荧光联合激光扫描共聚焦技术检测显示PKH26标记的外泌体均可在血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞出现,说明从iPS细胞获取的外泌体可以被这两种细胞有效吸收、摄取。另外,外泌体的膜性结构能够通过膜蛋白与靶细胞膜融合,极大地避免细胞吞噬-溶酶体途径带来的药物降解、细胞毒性和免疫原性等问题。

本研究提示iPS细胞外泌体可作为理想的天然载体,通过装载siRNA药物进入靶细胞,沉默或抑制NLRP3炎性小体来调控肺组织的炎症反应,减轻肺损伤,探索ALI基因治疗的新方法。

参考文献：

[1]周黎瑾,肖明第.体外循环手术中性粒细胞致肺损伤的机制[J].中国体外循环杂志,2010,8(1):61-64.

[2]张楠,刘苏,郭楠.体外循环所致炎性肺损伤机制[J].中国体外循环杂志,2009,7(1):59-61.

[3]Kolliputi N,Shaik RS,Waxman AB.The inflammasome mediates hyperoxia-induced alveolar cell permeability[J].J Immunol,2010,184(10):5819-5826.

[4]Kolliputi N,Galam L,Parthasarathy PT,et al.NALP-3 inflammasome silencing attenuates ceramide-induced transepithelial permeability[J].J Cell Physiol,2012,227(9):3310-3316.

[5]de Rivero Vaccari JP,Brand F 3rd,Adamczak S,et al.Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury[J].J Neurochem,2016,136(Suppl 1):39-48.

[6]Wang C,Hei F,Ju Z,et al.Differentiation of Urine-Derived Human Induced Pluripotent Stem Cells to Alveolar Type II Epithelial Cells[J].Cell Reprogram,2015.

[7]Herold S,Gabrielli NM,Vadasz I.Novel concepts of acute lung injury and alveolar-capillary barrier dysfunction[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2013,305(10):L665-681.

[8]梁栋,聂时南,刘红梅,等.NLRP3炎症体在肺损伤中的研究进展[J].临床急诊杂志,2014,15(11):698-701.

[9]Steinberg KP,Hudson LD,Gooodman RB,et al.Efficacy and safety of corticosteroids for persistent acute respiratory distress syndrome[J].N Engl J Med,2006,354(16):1671-1684.

[10]Liu Z,Zhao H,Liu W,et al.NLRP3 inflammasome activation is essential for paraquat-induced acute lung injury[J].Inflammation,2015,38(1):433-444.

[11]Han S,Cai W,Yang X,et al.ROS-Mediated NLRP3 Inflammasome Activity Is Essential for Burn-Induced Acute Lung Injury[J].Mediators inflamm,2015,2015:720457.

[12]Tian Y,Li S,Song J,et al.A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy[J].Biomaterials,2014,35(7):2383-2390.

[13]Stevanato L,Thanabalasundaram L,Vysokov N,et al.Investigation of Content,Stoichiometry and Transfer of miRNA from Human Neural Stem Cell Line Derived Exosomes[J].PloS one,2016,11(1):e0146353.

[14]Shimoda A,Ueda K,Nishiumi S,et al.Exosomes as nanocarriers for systemic delivery of the Helicobacter pylori virulence factor CagA[J].Sci Rep,2016,6:18346.

[15]Liu Y,Li D,Liu Z,et al.Targeted exosome-mediated delivery of opioid receptor Mu siRNA for the treatment of morphine relapse[J].Sci Rep,2015,5:17543.

[16]Munagala R,Aqil F,Jeyabalan J,et al.Bovine milk-derived exosomes for drug delivery[J].Cancer lett,2016,371(1):48-61.

[17]Thery C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc Cell Biol,2006,3:Unit 3.22.

(修订日期:2016-02-24)

(收稿日期:2016-02-24)

通讯作者：黑飞龙,E-mail:heifeilong@ 126.com

基金项目：国家自然科学基金面上项目(31370993)；北京协和医学院研究生创新基金(2015E-CX03)

DOI:10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2016.01.12

作者单位：100037北京,北京协和医学院中国医学科学院国家心血管病中心阜外医院体外循环中心