蒙古冰草茎尖愈伤组织及其再生植株诱导

赵 彦 ，陈雪英 ，云锦凤 ，刘湘萍

（1.内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区草品种育繁工程技术研究中心，内蒙古呼和浩特010018；3.草地资源教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；4.内蒙古农牧业科学院蔬菜研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）为冰草属多年生丛生禾草，二倍体（2n=14），是我国干旱草原和荒漠地带重要的禾本科牧草，产于我国北部沙漠以南边缘地带的干燥草原和沙地[1]。蒙古冰草具有抗旱、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠等优良特性，抗旱性尤其突出，根具沙套，是典型的旱生植物。蒙古冰草结实率、种子发芽率高，生命力强、适应性广，耐风沙的侵袭，是良好的固沙植物，也是荒漠草原和干旱草原地带退化草场补播的优良草种[2-3]。但是，由于生态环境变化、过度放牧等原因草原退化，该物种在种群数量上逐渐减少，是国家二级珍稀濒危植物和急需保护的农作物野生近缘种[4]。目前，已从形态学[5-7]、细胞学[8-11]，分子生物学及生产利用[12-15]等不同层面对蒙古冰草进行了研究。

植物组织培养技术常用于植物育种、种质资源的保存及其交换，随着生物技术的迅速发展，逐渐成为了生物工程的基础和关键环节之一，并且广泛应用在遗传、生化、生理、病理等研究上[16]。2004年霍秀文以蒙古冰草幼穗为外植体成功建立了再生体系，但幼穗作为外植体，取材时间上受季节限制，不能随时供应，存在一定的局限性[17-18]。因此，本试验试图打破这一局限，以蒙古冰草无菌苗的不同部位为外植体进行离体培养，利用常用植物激素，探索适宜的浓度配比，建立一套有效的以茎尖为外植体的蒙古冰草组织培养再生体系，为进一步的基因转化研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

蒙农1号蒙古冰草种子，2014年采收于内蒙古农业大学牧草试验站种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗培养 取蒙古冰草种子100粒，清水浸泡4～6 h，剥去内外稃，流水冲洗30 min，转入无菌操作台操作，无菌水冲洗3～5遍，再用75%乙醇进行表面消毒1 min，无菌水冲洗2～3次；用0.1%HgCl溶液处理7～10 min，无菌水冲洗3～5次，接种于MS培养基，培养无菌苗，每瓶接种20粒左右（图1）。

1.2.2 外植体选择 待无菌苗长至5～8 cm时，将幼苗从茎尖到顶部分割成5段，每段3～5 mm，并按此顺序编号为茎尖、茎段、叶片，接种于愈伤组织诱导培养基上，观察并统计愈伤组织诱导率和质量，筛选愈伤诱导率高的外植体进行愈伤组织诱导。

1.3 培养基配置

以MS基本培养基为主，添加不同激素浓度的组合，其中蔗糖3%，琼脂0.7%，pH值调至5.8，在121℃条件下高压灭菌20 min。

（1）愈伤组织诱导培养基 MS+（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L）2，4-D+ （0，0.05，0.10，0.20 mg/L）6-BA。（2）继代培养基 MS+1.5 mg/L 2，4-D。（3）分化培养基 MS+（2.0，3.0，4.0，5.0 mg/L）6-BA+（0.3，0.5，1.0 mg/L）NAA。（4）生根培养基 MS+0.5 mg/L NAA。

1.4 培养条件

愈伤组织诱导放入25℃的恒温培养室，暗培养20 d后转入继代培养基，继代培养2～3次，每隔21 d继代培养1次。挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，25℃光照培养，继代1～2次，待分化出苗后，转入生根培养基中进行生根培养。

1.5 数据统计

出愈率=愈伤组织数量/外植体数量×100%

分化率=分化成苗数量/愈伤组织数量×100%

2 结果与分析

2.1 适宜外植体的筛选

蒙古冰草幼苗的茎尖、茎段、叶片作为外植体，接种到添加1.5 mg/L 2，4-D的愈伤诱导培养基上，暗培养20 d后，统计愈伤组织的出愈率，观察愈伤状态。

统计结果表明，愈伤诱导率由高到低依次为：茎尖、茎段、叶片（表1）。茎尖的诱导率明显高于茎段，诱导率达到79.3%，愈伤组织质量较好；茎段的诱导率仅为46.0%，愈伤组织小，质量一般；叶片的愈伤诱导率仅为7.0%，且愈伤质量较差。因此，茎尖为诱导愈伤组织的最适外植体。

2.2 不同激素浓度对愈伤诱导的影响

以蒙古冰草茎尖作为外植体接种于不同激素水平的愈伤诱导培养基（表2）。2，4-D浓度设定5个梯度，分别为 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L；6-BA 浓度设定 4 个梯度，分别为 0，0.05，0.1，0.2 mg/L。

试验结果表明，MS+1.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L6-BA培养基的诱导率最高，达到84.9%，并且愈伤状态良好，为最适诱导愈伤培养基。其中2，4-D对蒙古冰草茎尖愈伤组织的诱导起主导作用，但浓度过高会抑制愈伤组织的产生，适量添加6-BA有助于提高愈伤组织诱导率和愈伤质量。

表1 不同部位外植体的愈伤诱导结果

表2 不同激素浓度对蒙古冰草茎尖愈伤诱导的影响

2.3 诱导分化

继代2次后，挑选紧实、颗粒状的愈伤组织，转到分化培养基中进行分化培养。结果表明，6-BA浓度为2.0 mg/L时，分化率最高。添加适宜NAA可以提高愈伤组织的分化率，其中以6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培养基分化率最高，到达53.2%（图2、表 3）。

表3 不同激素浓度组合条件下愈伤组织分化率

2.4 生根培养

待分化芽长到4～6 cm时，转入MS+0.5 mg/L NAA生根培养基中（图3），培养10 d左右，即可生根，生根率100%，每苗生根达到3条以上，根长5 cm左右。在生根培养基中培养20 d左右，即可移栽到花盆中。

2.5 移栽

再生植株需要室温炼苗3～7 d，用自来水冲洗掉根部所带的培养基，移栽到蛭石、沙土和营养土（1∶1∶1）中，成活率在 90%以上。

3 结论与讨论

对蒙古冰草组织培养及再生体系建立的研究较少，且外植体均为幼胚、幼穗、成熟胚等，但这些外植体或取材困难或受季节限制，尚未见到有关茎尖作为外植体获得再生植株的报道。本试验以蒙古冰草幼苗的不同部位为外植体，探讨了茎尖、茎段、叶片在生长激素2，4-D和细胞分裂素6-BA调控下的愈伤诱导率。结果表明，茎尖为最适宜的外植体，再生性好。最适宜的2，4-D浓度为1.5 mg/L，而以幼穗、幼胚为外植体的愈伤诱导培养基中，2，4-D的浓度为2.0 mg/L[19-20]。

在禾本科牧草愈伤组织诱导培养研究中，多以添加单一的生长素2，4-D作为诱导因子。也有研究表明，添加细胞分裂素，如6-BA可以很好地改善愈伤状态[20-21]。本试验也证实，当添加0.1 mg/L 6-BA时，愈伤状态明显较不添加时好，但对诱导效果没有明显作用。当2，4-D浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织诱导率平均为64.0%，2，4-D浓度为1.5 mg/L时，愈伤组织平均诱导率为69.05%，随2，4-D浓度增加，诱导率下降，愈伤组织质量也受影响，呈较严重的水渍状。可见，2，4-D浓度不宜过高，低浓度2，4-D有利于诱导蒙古冰草茎尖愈伤组织的形成，且愈伤组织质量好。当6-BA浓度为0 mg/L时，也可诱导愈伤组织的发生，最高诱导率可达到77.4%，但愈伤组织质量差，表面多为水渍状，结构松软。当添加0.1 mg/L 6-BA时，愈伤组织多为颗粒状，紧实，愈伤状态良好。

有研究表明，2，4-D是诱导体细胞胚性发生的重要激素，细胞分裂素6-BA对禾本科植物诱导愈伤组织分化的作用优于其他分裂素[22]，分化过程中应去掉2，4-D，添加生长素NAA有利于植株分化，也可促进再生苗生根[23]。本试验结果表明，当6-BA浓度为2.0 mg/L时，低浓度的NAA可提高愈伤组织的分化效率，促使再生苗健壮生长，且容易生根，幼苗生根率高，移栽成活率高。本试验也证实NAA浓度不宜过高，当NAA为1.0 mg/L时，抑制了愈伤组织的分化。

本试验通过对蒙古冰草不同部位的离体培养，筛选出了茎尖为诱导愈伤的适宜外植体。这是首次建立蒙古冰草营养体为外植体进行组织培养；并通过MS添加不同激素配比试验，建立了一套以蒙古冰草茎尖为外植体的再生体系，其中最适愈伤诱导培养基为 MS+2，4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L，最适分化培养基 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；生根培养基MS+NAA 0.5 mg/L。

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