铝碳酸镁对实验性胃溃疡的疗效及其机制探讨



铝碳酸镁对实验性胃溃疡的疗效及其机制探讨

沈飞1,2冀子中1陈淑洁2王岚2方燕飞2姒健敏2*

嘉兴市第一医院消化内科1(嘉兴市医学重点学科 胃肠病学 学科编号：04-Z-12)(314001)

浙江大学胃肠病研究所2

*本文通信作者，Email: sijm@zju.edu.cn

背景：铝碳酸镁已用于胃溃疡的治疗，但其具体机制尚不明确。目的：探讨铝碳酸镁对实验性胃溃疡大鼠的疗效及其作用机制。方法：建立实验性乙酸致大鼠胃溃疡模型，成模后分为对照组、铝碳酸镁低剂量组、铝碳酸镁高剂量组，分别给予0.9% NaCl溶液、880 mg·kg-1·d-1和1 230 mg·kg-1·d-1铝碳酸镁灌胃。14 d后，行大体评估，以HE、CD31、VG染色评估再生黏膜组织成熟度，AB-PAS染色、氨基己糖水平、免疫组化染色和血清表皮生长因子(EGF)、前列腺素(PG)E2评估功能成熟度。结果：与对照组相比，铝碳酸镁高剂量组溃疡指数(UI)明显降低(P<0.05)；铝碳酸镁低、高剂量组再生黏膜厚度增加(P<0.05)，囊状扩张腺体数量明显减少(P<0.01)，微血管密度(MVD)明显增加(P<0.01)，胶原纤维明显增多(P<0.05)；中性黏液分泌量和氨基己糖水平明显升高(P<0.01)，黏膜EGF、EGF受体(EGFR)和PGE2表达均明显增强(P<0.01)，血清EGF、PGE2水平明显升高(P<0.01)。结论：铝碳酸镁能明显提高溃疡再生黏膜组织和功能的成熟度，提高溃疡愈合质量，其机制可能为中和胃酸，增强黏液-HCO3-屏障，上调EGF、PGE2表达。

关键词胃溃疡；铝碳酸镁；溃疡愈合质量；治疗

Therapeutic Effect and Mechanism of Hydrotalcite on Experimental Gastric UlcerSHENFei1,2,JIZizhong1,CHENShujie2,WANGLan2,FANGYanfei2,SIJianmin2.1DepartmentofGastroenterology,JiaxingFirstHospital,Jiaxing,ZhejiangProvince(314001);2InstituteofGastroenterology,ZhejiangUniversity,Hangzhou

Correspondence to: SI Jianmin, Email: sijm@zju.edu.cn

Background: Hydrotalcite has been used in the treatment of gastric ulcer, but its mechanism is not clear. Aims: To investigate the efficacy and mechanism of hydrotalcite on experimental gastric ulcer in rats. Methods: Experimental acetic acid-induced gastric ulcer model was established in rats. Model rats were randomly assigned into control group, low and high dose hydrotalcite groups, and 0.9% NaCl solution, 880 mg·kg-1·d-1, 1 230 mg·kg-1·d-1hydrotalcite were intragastrically administrated, respectively. After 14 days, macroscopic examination was performed; and HE staining, CD31 staining and VG staining were used to evaluate the histological maturity, AB-PAS staining, level of hexosamine, immunohistochemical staining, serum levels of epidermal growth factor (EGF), prostaglandin E2(PGE2) were used to evaluate the functional maturity.Results: Compared with control group, ulcer index (UI) was significantly decreased in high dose hydrotalcite group (P<0.05). Thickness of restored mucosa was significantly increased (P<0.05), number of cystically dilated gland was significantly decreased (P<0.01), microvessel density (MVD), collagen fiber, secretion of mucus, level of hexosamine, expressions of EGF, EGR receptor (EGFR) and PGE2, serum levels of EGF and PGE2were significantly increased in low and high hydrotalcite groups (P<0.05,P<0.01). Conclusions: Hydrotalcite could obviously improve the histological and functional maturity of regenerative mucosa, as well as the quality of ulcer healing. The mechanism might be related to the neutralization of gastric acid, enhancement of mucus-HCO3-barrier and up-regulation of expressions of EGF and PGE2.

Key wordsStomach Ulcer;Hydrotalcite;Quality of Ulcer Healing;Therapy

胃溃疡因胃黏膜攻击因子与防御修复因子平衡失调而引发[1]。仅通过抑制胃酸分泌和(或)根除幽门螺杆菌(Hp)不足以完全消除溃疡底部炎症，难以实现高质量愈合[2]，容易导致复发。Si等[3]的研究发现，质子泵抑制剂治疗后溃疡年复发率为7.09%，在Hp感染患者中可达23.33%，根除Hp后复发率仍高达6.45%。以往铝碳酸镁主要用于治疗消化不良、胃酸过多等，现因其黏膜保护作用已用于治疗糜烂性食管炎、胃溃疡等。最初认为铝碳酸镁促进溃疡愈合的机制是中和胃酸，但近期有研究表明其对胃溃疡的治疗作用可能还存在其他途径[4]。本研究通过给予实验性胃溃疡大鼠铝碳酸镁，旨在探讨其对胃溃疡的疗效及其具体机制。

材料与方法

一、实验动物和主要药物、试剂

SPF级Wistar大鼠64只，体质量0.20～0.22 kg，雌雄各半(上海斯莱克实验动物有限责任公司)。

铝碳酸镁(拜耳医药保健有限公司)；BCA蛋白试剂盒(碧云天生物技术公司)；大鼠表皮生长因子(EGF)、前列腺素(PG)E2ELISA试剂盒(上海拜沃生物科技有限公司)；Anti-EGFR 抗体、Anti-PGE2抗体、CD31抗体(Abcam公司)；Anti-EGF 抗体(Biorbyt公司)；羊抗兔、羊抗鼠免疫组化二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

二、研究方法

1. 模型制备和实验分组：参考Kobayashi等[5]的研究，水合氯醛腹膜麻醉后，从腹腔移出胃，将0.02 mL 99.5%的乙酸注射至胃窦部后壁浆膜下近肌层处，出现直径约3 mm的半透明白斑后，将胃送还腹腔。制模3 d后选取已禁食24 h的16只大鼠，将胃取出后沿胃大弯剪开，在胃小弯后壁发现一典型的黏膜缺损，表面覆白苔，周围黏膜水肿，确认实验性胃溃疡大鼠模型成功建立。将剩余48只造模成功的大鼠随机分为对照组、铝碳酸镁低、高剂量组3组，每组各16只。对照组大鼠给予1 mL 0.9% NaCl溶液灌胃，铝碳酸镁低、高剂量组分别给予880 mg·kg-1·d-1和1 230 mg·kg-1·d-1铝碳酸镁灌胃[6](按临床使用剂量换算成大鼠等效剂量)。

2. 标本采集和处理：治疗14 d后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，刮取胃溃疡周边黏膜，-80 ℃保存，用于后续实验。

3. 大体检查：观察胃窦部溃疡的大小、深浅、基底清洁度、有无覆白苔等情况，计算溃疡指数(UI)和抑制率[7]。UI(mm2)=溃疡最长径×最大宽径。溃疡抑制率(%)=(1-给药组UI均值/对照组UI均值)×100%。

4. 溃疡愈合质量组织成熟度相关指标观察

①HE染色：光学显微镜(×40)下定标后，测量切片中再生黏膜上皮细胞表面到黏膜肌层之间的距离(μm)。高倍镜(×200)下，随机选取1个视野，计数再生黏膜内呈囊状扩张的腺体数量。

②CD31染色：光学显微镜(×200)下找到血管高密度区，随机选取5个视野，计数肉芽组织中已形成管腔结构的毛细血管(不计数已形成明显肌层的毛细血管)，取均值，作为该溃疡基底肉芽组织的微血管密度(MVD)。

③VG染色：光学显微镜(×200)下随机选取5个视野，测量切片中VG染色阳性的面积，计算该阳性面积占肉芽组织总面积的百分比和平均光密度，取均值，以此评估该溃疡肉芽组织胶原纤维含量。

5. 溃疡愈合质量功能成熟度相关指标观察

①AB-PAS染色：光学显微镜(×200)下选取5个视野，测量中性黏液PAS染色阳性面积，计算该阳性面积占再生黏膜总面积的百分比和平均光密度，取均值，以此评估再生黏膜中性黏液含量。

②胃黏膜组织氨基己糖水平：参考冯敬池等[8]的方法，测定胃黏膜组织氨基己糖水平。

③免疫组化染色：以免疫组化法检测胃黏膜EGF、EGFR、PGE2表达。

④血清EGF、PGE2检测：使用ELISA法，按照试剂说明书步骤检测血清EGF、PGE2水平。

三、统计学分析

结果

一、胃黏膜大体检查

对照组、铝碳酸镁低、高剂量组分别有13、10、9只大鼠肉眼可见溃疡。对照组溃疡面巨大，其上被覆白苔，溃疡底较污秽，周围黏膜水肿隆起；铝碳酸镁低、高剂量组溃疡均较表浅，底面有浅白苔，周围黏膜水肿隆起较浅(图1)。铝碳酸镁高剂量组UI明显低于对照组，溃疡抑制率明显高于铝碳酸镁低剂量组(表1)。

二、溃疡愈合质量组织成熟度相关指标观察

与对照组相比，铝碳酸镁高剂量组再生黏膜厚度明显增加(P<0.05)，低剂量组无明显差异；铝碳酸镁低、高剂量组囊状扩张的腺体数量均明显减少(P<0.01)，MVD明显增加(P<0.01)，VG染色平均光密度明显增加(P<0.05)。而铝碳酸镁低、高剂量组之间各指标差异无统计学意义(表2)。

三、溃疡愈合质量功能成熟度相关指标观察

与对照组相比，铝碳酸镁低、高剂量组AB-PAS阳性染色面积百分比和平均光密度明显升高(P<0.05，P<0.01)，胃黏膜组织中氨基己糖水平明显升高(P<0.01)，EGF阳性染色面积百分比和平均光密度均明显升高(P<0.01)，EGFR阳性染色面积百分比和平均光密度均明显升高(P<0.01)，PGE2阳性染色面积百分比和平均光密度明显增加(P<0.01，P<0.05)；血清EGF和PGE2水平明显升高(P<0.01)。而铝碳酸镁低、高剂量组之间上述指标差异均无统计学意义(图2、表3)。

表1　各组胃黏膜UI和溃疡抑制率比较

*与对照组比较，P<0.05

A：模型组；B：对照组；C：铝碳酸镁低剂量组；D：铝碳酸镁高剂量组

组别例数▲再生黏膜厚度(μm)囊状扩张的腺体数量MVDVG阳性染色面积百分比(%)平均光密度对照组16/8354.5±141.35.9±3.164.2±9.527.2±6.40.43±0.04铝碳酸镁低剂量组16/8412.9±141.13.3±2.7**93.0±17.2**36.3±6.1*0.50±0.06*铝碳酸镁高剂量组16/8494.7±161.0*1.9±1.8**103.4±15.4**33.4±5.90.49±0.05*

▲检测再生黏膜厚度、囊状扩张的腺体数量的大鼠数量为16只，检测MVD、VG阳性染色面积百分比、平均光密度的大鼠数量为8只；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

A：对照组；B：铝碳酸镁低剂量组；C铝碳酸镁高剂量组

有研究指出，溃疡经治疗后，即使内镜下愈合，仍存在组织学和超微结构异常，如再生黏膜厚度较正常黏膜降低、腺体数量减少、腺体结构相对紊乱且呈囊状扩张、微血管数目减少等，其防御能力降低，从而成为溃疡复发的基础[9]。该研究首次提出溃疡愈合质量的概念，认为溃疡愈合不仅需要黏膜缺失的修复，更需要黏膜下组织结构的修复重建，形态学的修复并不能代表组织学和功能学的完全恢复，必须兼顾组织和功能的恢复。

常用的评价组织结构成熟度的指标包括[10-12]：①上皮组织：以再生黏膜厚度、腺体的高度和数量、腺体排列状况、腺体囊状扩张程度以及腺细胞的形态、分化程度来衡量；②肉芽组织：以成纤维细胞数量、新生血管数量、分布构象、胶原纤维以及黏膜肌层的再生状况、炎症细胞浸润程度来衡量。

±s)

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

再生黏膜厚度可代表上皮的增生程度，再生黏膜内呈囊状扩张的腺体数量可代表腺体的重构和成熟状况，肉芽组织中的微血管数和胶原纤维含量则说明了黏膜下结构的重建情况。由此可见，高质量愈合的溃疡再生黏膜厚度高、囊状扩张腺体数量少，新生毛细血管网丰富，且肉芽组织胶原纤维含量高。本研究结果显示铝碳酸镁能增加再生黏膜厚度、减少囊状扩张腺体数量，同时能明显促进肉芽组织胶原纤维和微血管生成，说明铝碳酸镁可明显提高溃疡愈合的组织成熟度。

可通过以下指标评价再生黏膜功能的成熟度[10-12]：①微循环状况：测定黏膜血流；②糖蛋白含量测定和糖构成分析；③细胞因子如PG、EGF、碱性成纤维细胞生长因子水平测定以及三磷酸腺苷、二磷酸腺苷定量分析；④再生黏膜上皮细胞分泌黏液的功能；⑤受体表达，如多巴胺受体、EGFR等。

黏液是由胃上皮细胞和胃腺颈黏液细胞分泌的具有黏滞性的糖蛋白凝胶，覆盖于胃黏膜表面和小凹表面，具有稀释有毒物质的作用。黏液可与胃黏膜组成黏膜屏障，保护黏膜免受腔内H+、胃蛋白酶、微生物等损害，同时随着溃疡的修复，其分泌量逐渐增加，黏膜防御功能随之提高，因此黏液的分泌量是评价再生黏膜功能成熟度的指标之一[13]。氨基己糖为胃黏液中糖蛋白的主要组成成分，可客观反映胃黏液的分泌情况，作为判断胃黏膜屏障功能、确定药物疗效的重要生化指标[14]。

EGF为存在于各种腺体、胃液、血液中的一种多肽，不仅具有抑制胃酸分泌，增加胃黏膜血流量，促进胃黏膜上皮细胞增殖的作用，而且能促进表面上皮细胞透明质酸酶的合成、成纤维细胞生长以及胶原产生。EGFR属跨膜受体酪氨酸蛋白激酶家族，胃黏膜受损时，EGF与细胞膜上EGFR结合，促进上皮细胞增殖、分化和移行，并刺激肉芽组织内微血管形成，改善微循环，同时抑制胃酸分泌。

PGE2为公认的细胞保护因子，其保护机制为：①抑制胃壁细胞的胃酸分泌，不仅对基础胃酸分泌有抑制作用，对组胺、五肽胃泌素等引起的胃酸分泌同样具有抑制作用；②刺激黏膜基底细胞向表面移行，促进胃黏膜上皮细胞再生；③扩张血管，增加黏膜血流量，促进胃黏膜受损上皮细胞的重建和增殖；④促进浅表细胞黏液和碳酸氢盐的分泌，增强胃黏膜细胞对损伤因子的抵抗力；⑤激活环磷酸腺苷酶，促进表面活性磷脂的释放，维持黏膜巯基化合物，稳定溶酶体和细胞膜；⑥刺激多种生长因子的产生而促进组织修复。

本研究结果显示铝碳酸镁能明显提高血清EGF和PGE2水平、胃溃疡再生黏膜处EGF、EGFR、PGE2表达、胃黏膜组织中黏液和氨基己糖水平，说明铝碳酸镁可明显提高溃疡愈合的功能成熟度。

目前国内有关铝碳酸镁对胃溃疡的疗效及其作用机制的研究鲜见报道，国外Schmassmann等[15]发现，在奥美拉唑治疗的基础上加用铝碳酸镁可明显改善溃疡愈合的结构成熟度。且铝碳酸镁可促进再生黏膜中EGF和EGFR表达[6]，但未进行全面系统分析。本研究进一步从组织和功能成熟度两方面分析铝碳酸镁对溃疡愈合的作用机制，结果显示铝碳酸镁能明显促进溃疡愈合和提高溃疡抑制率，其可能机制为中和胃酸，增强黏液-HCO3-屏障，上调EGF、PGE2表达以达到其对胃黏膜的细胞保护作用。其中提高血液EGF、PGE2水平，增加再生黏膜EGF、EGFR、PGE2表达可能为其促进溃疡愈合的分子学基础。这对在胃溃疡患者治疗中应用铝碳酸镁具有重要指导意义。但由于本研究为动物实验，无法得知胃溃疡相关症状是否得到缓解；且仅进行了对照组与铝碳酸镁组的比较，未进行大鼠治疗前后自身比较，无法得知胃溃疡的病程是否缩短。此外，根据实验动物结果不等同于临床结果，还有待于进一步深入探索和验证。

参考文献

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(2015-11-10收稿；2015-12-10修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.03.004