CD-DST技术在结直肠癌术后辅助化疗的个体化应用

郭惠玲，任圣男，金洪永，高素洁，房学东，陈学博*

(吉林大学中日联谊医院 1.胃肠结直肠肛门外科;2.麻醉科,吉林 长春130033)



CD-DST技术在结直肠癌术后辅助化疗的个体化应用

郭惠玲1，任圣男1，金洪永1，高素洁2，房学东1，陈学博1*

(吉林大学中日联谊医院 1.胃肠结直肠肛门外科;2.麻醉科,吉林 长春130033)

摘要：目的探讨胶原凝胶滴包埋肿瘤细胞培养法化疗药物敏感性检测技术(CD-DST)对结直肠癌术后辅助化疗的指导作用及临床应用可行性。方法将30例结直肠癌患者的新鲜手术标本分别对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康3种化疗药物进行CD-DST检测，观察检测成功率、药物敏感性差异。以CD-DST检测结果为指导治疗的患者28例作为实验组，未行CD-DST检测以传统经验治疗的30例患者作为对照组，研究检测结果与临床疗效的一致性，比较2组患者术后1年的无进展生存期(PFS)。结果(1)检测成功率为93.3%(28/30)。三种化疗药物的敏感率分别为(35.7%，35.7%，28.6%)(2)实验组和对照组1年的无进展生存期[(92.9%(1/28)vs 83.3%(5/30)]差异有统计学意义(P<0.05)。结论CD-DST技术对结直肠癌术后辅助化疗的方案选择具有一定的临床指导价值。

关键词：CD-DST；结直肠癌；个体化应用

(ChinJLabDiagn,2016,20:0405)

术后辅助化疗仍是目前结直肠癌综合治疗中重要的手段之一。临床医生对结直肠癌患者术后辅助化疗的选择多参照NCCN指南推荐或经验性用药为主，由于肿瘤的异质性，即使是同一类型肿瘤同一化疗方案的患者临床疗效及预后差别显著，对于化疗效果不佳的患者承受了巨大的病痛之苦以及沉重的经济负担。胶原凝胶滴包埋肿瘤细胞培养法化疗药物敏感性检测技术(collagen geldroplet embedded culture drug sensitivity test CD-DST)是一种化疗药物体外药敏检测技术，它与其他检测技术相比，具有培养成功率高、所需细胞少、细胞的生物学特性与体内相似、结果与临床一致性高等优点。我科自2013年6月开展此项目以来对30例患者术中新鲜肿瘤标本进行检测，目的是探讨CD-DST技术在结直肠癌术后辅助化疗个体化应用的意义。

1资料与方法

1.1病例选择

收集吉林大学中日联谊医院新民院区从2013年6月到2014年2月间连续收治的结直肠癌患者60例，年龄28-79岁，中位年龄为56岁，所有患者均经术前肠镜及病理结果确诊，术前盆腔MR或腹部CT检查确定，按照2013年NCCN指南的TNM分期，术前分期均为T3N1-2M0-1的III、IV期。术后病理证实需要行术后辅助化疗。随机选取30例患者行CD-DST检测，根据检测结果指导术后辅助化疗的为实验组(CD-DST组)，其余30例患者根据2013年版NCCN指南推荐进行术后辅助化疗作为对照组(control组)。两组患者的年龄、性别、TNM分期、病理类型、淋巴结转移数等均无统计学意义。

1.2治疗方案

两组患者术前均未行任何放化疗，充分术前准备后行结肠癌根治或直肠癌根治手术，术后无严重出血、肠瘘、肠梗阻等并发症，于术后3周开始进行化疗。对照组患者根据2013年版NCCN指南推荐给予XELOX方案，出现复发后给予FOLFRI方案或联合分子靶向治疗。实验组患者根据CD-DST检测结果决定选择XELOX，FOLFRI或单药口服等方案，若对三种化疗药物均耐药，则在化疗基础上联合分子靶向治疗。所有患者均完成6-8疗程化疗。通过门诊或电话随访，包括每3-6个月复查肿瘤标志物(CEA和CA199)、盆腔CT或腹部CT检查，到发现肿瘤复发或进展后终止随访。

1.3主要试剂及仪器

1.3.1主要试剂5-氟尿嘧啶注射液(天津金耀)；注射用奥沙利铂(哈药集团)；伊立替康注射液(sigma)；培养液DMEM/F12(hyclone)；特级胎牛血清(Gibco)；10%中性福尔马林(北京益利精细化学品有限公司)；PBS(biotopped)；EGTA(Genview)；EZ酶、制胶原液A、B、C、PCM-1、PCM-2培养液、胶原凝胶包被培养瓶(购自korabo公司)。

1.3.2主要仪器HWS-24型电热恒温水浴锅(昆山一恒仪器)；DHG-9140A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器)；SW-CJ-2FD型双人单面垂直净化工作台(苏州智净设备有限公司)；KQ2200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CKX41型倒置显微镜(Olympus)；XA205DU型电子天平(梅特勒)；TDZ5-WS型台式离心机(湖南湘仪)；YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅医疗设备)；HERAcell150i型二氧化碳培养箱(热电)；Primage 图像分析系统(Kurabo)。

1.4研究方法

CD-DST技术对结直肠癌细胞抗癌药物敏感性检测实验。

1.4.1样本前处理在无菌条件下，用眼科剪把新鲜肠癌组织剪成0.5-1.0 mm3碎块，用刀片将其切碎成泥状。收集肿瘤组织并使用细胞分散酶EZ 37℃、CO2培养箱消化3 h。

1.4.2样本预培养终止消化后，EGTA-Trypsin处理细胞沉淀使组织进一步分散，300 μm膜过滤，将细胞液收集到50 ml离心管中，离心去上清，加入5-10 ml PCM-1培养基，吹散混匀。将细胞悬液移入胶原凝胶包被培养瓶中，37℃、CO2培养箱中培养24 h。

1.4.3胶原凝胶滴培养预培养后，弃去胶原凝胶包被培养瓶中未贴壁死细胞，EZ酶消化后，EGTA-Trypsin处理成细胞悬液。125 μm膜过滤，吸出少量细胞，进行活细胞计数，用含10%FBS的DMEM/F12培养基调整细胞浓度为(2-5)×106/ml。在冰水上预冷50 ml离心管加入试剂盒胶原凝胶制备套装中A、B、C溶液，制成胶原原液。将离心后的细胞分散液加入到胶原原液中，使细胞最终密度为(2-5)×105/ml。取30 μl胶原混合液滴注到6孔培养板上制成胶原凝胶滴，每孔接种3滴。待胶原凝胶滴凝固后，在6孔板中加入3 ml 10%FBS的DMEM/F12培养基，37℃、CO2培养箱中培养12-24 h。

1.4.4抗癌药物接触向6孔培养板中分别加入抗癌药稀释液5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康，同时设不加药对照孔。

1.4.5抗癌药物去除和清洗及无血清培养待药物作用24 h，吸除6孔板中培养基，每孔加入4 ml DMEM/F12培养基清洗除去抗癌药物，重复2次。去除抗癌药物后，在每孔中加入4 ml PCM-2，37℃、CO2培养箱中培养7天。

1.4.6固定和染色通过中性红固定染色干燥后，使用Primage图像分析系统读数，保存结果。

1.4.7判断标准评价指标用T/C的百分比值表示，其中T为加药处理组的光密度值，C为对照组光密度值。肿瘤细胞存活率越低，说明受试药物对肿瘤细胞的杀伤力越强，肿瘤细胞对药物越敏感。如果T/C的百分比值≤50%时，说明个体肿瘤细胞对相应药物敏感度较高；如果50%

1.5统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验，应用Kaplan-Meier法计算无进展生存期。

2结果

2.1CD-DST检测结果

30例检测患者有28例顺利完成检测，检测成功率为93.3%(28/30)，2例检测失败原因分别为样本量过少和样本受到污染。实验组28例患者中有10例对三种药物均耐药，完全耐药率为：35.7%，12例(42.9%)对一种药物敏感，5例(17.9%)对两种药物敏感，仅有1例(3.6%)对三种药物均敏感。三种化疗药物的敏感率分别为：5-氟尿嘧啶35.7%(10/28)，奥沙利铂35.7%(10/28)，伊立替康28.6%(8/28)，三种化疗药物之间的敏感率无显著性差异(表1)。

2.2CD-DST法指导化疗对1年无进展生存期PFS的影响

对两组全部患者通过门诊及电话随访，无1例失访，根据肿瘤标志物(CEA和CA199)、盆腔CT或腹部CT检查结果来判定肿瘤复发或进展。CD-DST组一年的PFS(96.4%)显著高于对照组(83.3%)，差异具有统计学意义(图1)。

表1　三种化疗药物的敏感率对比

图1　CD-DST法指导化疗对1年无进展生存期PFS的影响

统计到一年的无进展生存期(PFS)，对照组(control组)一年的PFS为83.3%(25/30)，CD-DST组一年的PFS为96.4%(27/28)，二者差异具有统计学意义(P=0.047)。

3讨论

虽然外科手术技术不断提高，精细化解剖的手术根治、化疗药的不断更新换代，但是结直肠癌的治疗仍然没有质的飞跃，由于结直肠癌具有高度的异质性[1]，可能导致了分期相同、治疗相同的结直肠癌患者的预后会截然不同。

3.1术后辅助化疗的现状和个体化趋势

术后辅助化疗是结直肠癌综合治疗中的关键，对手术后肿瘤的复发和转移、患者的预后起到至关重要的作用，目前常见的结直肠癌的化疗方案包括：FOLFOX4,XELOX,FOLFRI,FOLFOXRI,希罗达或替吉奥单药等。对结直肠癌的术后辅助化疗多以NCCN指南为参照给予以铂类为主的经验性用药为主，且各地医生的用药习惯差异较大，成为患者术后辅助化疗的选择的决定因素，然而，肿瘤本身存在异质性，即使是同一类型肿瘤同一化疗方案的患者的临床疗效及预后会有明显差别，化疗的整体有效率仅为30%左右，有相当一部分患者因为化疗效果不佳而承受病痛之苦、给家庭带来沉重的经济负担，对我国的医保资金也是一种浪费。经验用药无法保证肿瘤患者个体的有效性，规范化治疗也是针对群体疗效提高为目的，仍不能保证肿瘤患者的个体化治疗。因此，肿瘤的个体化治疗越来越受到医生、患者及家庭的关注，肿瘤的分子诊断、体外抗癌药物敏感试验等均是个体化治疗的发展趋势。个体化技术的先进程度与临床实用性之间的关系：从基因、蛋白质表达、细胞培养到人体及临床试验，临床效果相关度逐渐提高。

体外抗癌药物敏感试验为患者的术后辅助化疗的方案选择提供了一种客观有效的参考。常见的有ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA法)、四氮唑衍生物比色法(MTT法)、组织块培养终点染色计算机图像分析法(TECIA法)以及胶原凝胶滴包埋肿瘤细胞培养法化疗药物敏感性检测技术(CD-DST)等。传统体外抗癌药物敏感试验的常见问题包括：原代培养成功率低、药物接触浓度过高导致真阳性率低、无法区分混在一起的成纤维细胞和癌细胞、缺乏临床验证数据等。这可能是目前临床医生较少选择该类实验进行化疗药物选择的原因。因此，准确快速的抗癌药敏试验对个体化治疗结直肠癌具有重要意义。

3.2CD-DST 法的特点和优势

CD-DST法具有培养成功率高、所需细胞少、细胞的生物学特性与体内相似、结果与临床一致性高等优点。它具有无血清的增殖培养基可以有效抑制成纤维细胞增殖。Higashiyama等[2]对胸膜间皮瘤研究CD-DST检测的敏感度100%，特异度36%，准确度50%。

CD-DST法具有良好的肿瘤缩小效果预见性。Takamura等[3]报道59例乳腺癌患者根据CD-DST检测结果指导治疗，高敏感患者临床有效率达87.5%，而低敏感患者为3.6%。说明试验结果与临床一致性高。Yamagami等[4]个案报道1例卵巢囊性畸胎瘤晚期伴广泛转移，经CD-DST法,筛选敏感化疗药物，经6个周期化疗后临床症状完全缓解。该法于2004年在日本作为先进医疗方法被广泛应用，且被日本厚生省列为医疗保险项目。Ochiai T等[5]对结直肠癌患者使用CD-DST检测建立AUC-IR50曲线判断5-氟尿嘧啶的敏感性，认为CD-DST法将成为选择5-氟尿嘧啶治疗的必要参考条件。在消化道肿瘤方面，Ochiai T等[6]还通过CD-DST法检测对进展性结肠癌患者的奥沙利铂或伊立替康联合5-氟尿嘧啶时的效果，认为FOLFRI应该作为5-氟尿嘧啶低敏感患者的一线化疗方案。国内谭志军等[7]对胃癌标本进行CD-DST检测评价了多种化疗药物的敏感性，具有良好的临床指导价值。

本研究中通过对30例结直肠癌患者进行CD-DST法检测，检测成功率为93.3%(28/30)，应取黄豆大小的标本较为合适，取结直肠癌样本时，由于容易受到粪便的污染，除需要充分清洗干净外，还应该在抗生素的培养液中再次清洗，同时准备双份标本，以防止取材失败，随着取样经验的增加和检测技术的熟练，即使是有细菌污染的结直肠癌的手术标本的检测成功率仍是比较高的。三种化疗药物的整体敏感性在28.6-35.7%。而对三种化疗药物均敏感的仅有1例。三种化疗药物之间的敏感率并无显著性差异。根据检测结果指导治疗的CD-DST组一年的无进展生存期显著高于对照组，具有统计学意义，说明CD-DST法检测指导化疗药物选择提高了临床的疗效。

综上所述，CD-DST技术对结直肠癌患者的个体化治疗及临床化疗药物的指导具有一定的价值，避免经验性临床用药的盲目性，在一定程度上可以改善预后，提高患者的生存期。然而，不同的联合化疗方案对结直肠癌细胞的敏感性不同，针对联合化疗方案的CD-DST检测是今后研究的方向。

参考文献：

[1]王利峰,俞金龙,陈海金.结直肠肿瘤异质性及个体化靶向治疗[J].广东医学,2014,14:2290.

[2]Higashiyama M,Oda K,Okami J,et al.In vitro-chemosensitivity test using the collagen gel droplet embedded culture drug test (CD-DST) for malignant pleural mesothelioma:possibility of clinical application[J].Ann Thorac Cardiovasc Surg,2008,14(6):355.

[3]Takamura Y,Kobayashi H,Taguchi T,et al.Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers[J].Int J Cancer,2002,98(3):450.

[4]Yamagami W,Banno K,Kawaguchi M,et al.Use of the collagen gel droplet embedded drug sensitivity test to determine drug sensitivity against ovarian mature cystic teratoma with malignant transformation to adenocarcinoma:a case report[J].Chemotherapy,2007,53(2):137.

[5]Ochiai T,Nishimura K,Watanabe T,et al.Evaluation of the individual 50% inhibitory area under the concentration curve of 5-fluorouracil based on the collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test in colorectal cancer[J].Mol Med Rep,2009,2(3):405.

[6]Ochiai T,Nishimura K,Watanabe T,et al.Leucovorin and fluorouracil plus oxaliplatin or leucovorin and fluorouracil plus irinotecan as individualized first-line therapy based on a drug sensitivity test[J].Exp Ther Med,2010,1(2):325.

[7]谭志军,姜伟,谷川,等.胶滴肿瘤药敏试验检测胃癌细胞化疗敏感度[J].肿瘤防治研究,2011,09:1074.

The Individual application of CD-DST technology in adjuvant chemotherapy after operation for colorectal cancer

GUOHui-ling,RENSheng-nan,JINHong-ying,etal.

(DepartmentofGastrointestinalColorectalandAnalSugery,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the guiding role and the feasibility of collagen gel droplet-embedded culture drug-sensitivity test(CD-DST) in adjuvant chemotherapy after operation for colorectal cancer.MethodsThe surgery- specimens of thirty patients with colorectal cancer were carried out the CD-DST test for 5-FU ,oxaliplatin and irinotecan.twenty-eight patients were included in pilot group receiving chemotherapy guided by the result of CD-DST test,and thirty patients received traditional chemotherapy for colorectal cancer were in control group.The postoperative and one-year survival rate were compared between the two groups Results(1)The CD-DST test was success in twenty-eight of thirty patients(93.3%),and sensitivity rate of three drugs was respectively 35.7%,35.7% and 28.6%.(2)The progression free survival in pilot and control group was respectively 92.9%(1/28) and 83.3%(5/30)(P<0.05).ConclusionCD-DST technology has a certain value in applying valid chemotherapy in colorectal caner.

Key words:CD-DST;colorectal cancer;individual application

(收稿日期：2015-10-10)

文献标识码：A

中图分类号：R730.53

文章编号：1007-4287(2016)03-0405-04

*通讯作者

基金项目：吉林省科学技术厅(201201037)