黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

卢苇,荣俊 (长江大学生命科学学院,生物医药研究所,湖北荆州434100)匡红艳 (长江大学生物医药研究所,长江大学临床医学院,湖北荆州434000)余知和 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434100)



黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

卢苇,荣俊 (长江大学生命科学学院,生物医药研究所,湖北荆州434100)
匡红艳 (长江大学生物医药研究所,长江大学临床医学院,湖北荆州434000)
余知和 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434100)

[摘要]目的:为大量生产医用尿酸氧化酶,对一个黑曲霉菌株的尿酸氧化酶基因进行了克隆和在大肠杆菌中的异源表达。方法:基因测序结果显示,克隆的黑曲霉尿酸氧化酶基因全长为909bp,编码302个氨基酸残基。SDS-PAGE和非变性电泳分析结果显示,单体酶分子量在35～37kDa之间；表达过程中酶蛋白分子自我组装成4聚体蛋白,聚合体蛋白的表观分子量为140～150kDa。结果:酶蛋白在大肠杆菌细胞液中表达,产物几乎完全以水溶状态存在,最佳溶解pH为8.0。最佳酶促反应温度为35℃。经过诱导表达后的菌体,按照1∶20(质量/体积)比例重悬于最优缓冲液中,进行超声波破碎后,粗酶液活力为67.69IU/mL,比活性为47.00IU/mg。结论:提供了一个微生物来源尿酸氧化酶新的获取方法。

[关键词]尿酸氧化酶；黑曲霉；表达；最佳溶解pH；最适反应温度

[引著格式]卢苇,荣俊,匡红艳,等.黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达[J].长江大学学报(自科版),2016, 13(6):1～6.

尿酸氧化酶(UrateoxidaseorUricase,EC.1.7.3.3)是大多数生物体内普遍存在的一种酶,它能催化尿酸氧化成为尿囊素和过氧化氢。人和猿类在进化过程中发生了尿酸氧化酶基因沉默,体内缺乏有活性尿酸氧化酶[1,2]。人和猿类以尿酸作为嘌呤代谢的最终产物,如果嘌呤分解增多产生过量的尿酸,或者尿酸排泄障碍,都会导致血液中的尿酸浓度升高形成高尿酸血症,长时间尿酸过高就会导致痛风[3,4]。尿酸氧化酶可用于高尿酸血症、肿瘤溶解综合征和痛风等的治疗[5,6],也可用于血尿酸检测试剂盒的制备[7,8],是一种用途极其广泛的医药用酶制剂。现在已有多种不同来源的尿酸氧化酶得到了制备或表达[9,10],这些酶的物理化学性质有较大差异。哺乳动物来源的尿酸氧化酶,在pH7.0～7.4条件下难以溶解[11],酶的活力相对较低。微生物分解尿酸能力强,在生理pH条件下溶解度较高[12],是尿酸氧化酶的重要来源。近年来制备微生物来源的尿酸氧化酶,包括真菌、酵母和细菌,成为研究人员关注的重点[13]。为获得廉价且物理化学性质更优的尿酸氧化酶制剂,我们用本实验室分离的黑曲霉菌株为基因来源,克隆了黑曲霉尿酸氧化酶基因,并用该基因高效表达出了重组黑曲霉尿酸氧化酶(recombinant AspergillusnigerUrateoxidase,rANUO)。

1　材料与方法

1.1试剂

TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix,Trans1-T1PhageResistentChemicallyCompetent cell,E.coliBL21(DE3)感受态细胞,T4DNALigase均为北京全式金生物技术有限公司产品；Trizol试剂为Invitrogen产品；原核表达载体pET28a为本实验室保存；DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒均为Axygen公司产品；pMD18-T Vector,TaKaRa(大连)产品；限制性内切酶HindⅢ、NcoⅠ-HF为NewEnglandBiolabs产品。黑曲霉(Aspergillusniger)由本实验室分离并保存。

1.2 仪器

Bio-radGelDocEZImager(美国Bio-rad公司产品)；Mini-proteanTetraSystem(美国Bio-rad公司产品)；PowerPacBasic(美国Bio-rad公司产品)；Centrifuge5430R恒温离心机(德国eppendorf公司产品)；IS-RDD3恒温振荡器(美国crystal公司产品)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津shimadzu公司产品)；WD-9403B紫外仪(北京六一仪器厂产品)；SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯公司产品)。

1.3方法

1)黑曲霉培养基的配制与黑曲霉的培养 以尿酸为唯一氮源的液体培养基的配制方法:KH2PO41g、Na2HPO41.5g、MgSO4·7H2O0.2g、KCl0.5g、FeSO40.01g、甘油10g、尿酸1g,加水定容至1L,121℃灭菌20min,冷却至室温。取500mL培养基,用接种环接入少量黑曲霉,置28℃, 250rpm,震荡培养5d。

2)黑曲霉尿酸氧化酶基因的RT-PCR扩增 将上述在以尿酸为唯一氮源的液体培养基中培养出的黑曲霉菌置于12000rpm,10min,4℃离心,弃上清,将沉淀的菌团用液氮冷冻,再用研钵研成粉末,用Trizol试剂提取总RNA。以总RNA为模板,用Oligod(T)18作引物,用TransScriptFirst-StrandcDNA SynthesisSuperMix进行逆转录,温度参数:42℃60min；85℃5min,得cDNA。

根据GenBank公布的序列(ACCESSION:XM_001399702)设计引物,上游引物5’-CCCATGGGCTCT TCCCCAGTTACTGCGGCCCGC(下划线为NcoⅠ识别序列),为了使NcoⅠ限制酶切位点完整,在起始密码子后添加了一组编码甘氨酸的密码子GGC。下游引物5’-AAGCTTCTACAGCTTCGTGT TGCGACC(下划线为HindⅢ识别序列)。上、下游引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA为模板进行PCR扩增,温度循环参数:94℃5min；94℃45s,58℃45s；72℃60s,35个循环；72℃10min。用DNAGelExtractionKit回收扩增产物,与pMD18-Tvector连接。用连接产物转化Trans1-T1 PhageResistentChemicallyCompetentcell,用小量质粒抽提试剂盒提取阳性转化菌质粒DNA,命名为:pMD18-T-rANUO。同时将阳性菌送上海生物工程有限公司测序。

3)原核表达载体的构建 将pMD18-T-rANUO用HindⅢ,NcoⅠ分步酶切,回收酶切产物。再与经过同样酶切处理的pET28a表达质粒载体连接,重组质粒命名为pET28a-rANUO。该表达质粒的构建方式删除了pET28a质粒载体上的全部标签,可用来构建无标签的基因表达工程菌。用该表达质粒转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞,经PCR鉴定为阳性的转化菌命名为E.coliBL21(DE3)/ pET28a-rANUO。

4)rANUO的诱导表达 将E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO,接种于25mL含卡那霉素的LB液体培养基中,200rpm,37℃,培养过夜。取饱和菌液按2%比例,接种于1000mL含卡那霉素的LB液体培养基中,200rpm,37℃培至OD600的值约0.8时,加0.6mol/L乳糖至终溶度为24mM,诱导培养6h收菌。10000rpm,4℃,离心20min,弃上清培养液收菌体并称重。

5)rANUO提取pH条件的筛选 将诱导表达的湿菌体按1∶20(W∶V)比例分别加入pH6.0、7.0、7.4、8.0的0.1M磷酸缓冲液,和pH9.0和10.0的0.1M碳酸缓冲液。破菌时的缓冲液体积相当于培养基体积的1∶10。充分重悬菌体后,置于冰浴中用超声波破菌。破菌条件为功率200W,工作时间5s×150次,间隙时间10s。破菌完成后,置4℃,10000rpm离心10min,离心后取上清测定表达酶活力。

6)rANUO活性测定及蛋白含量分析 尿酸氧化酶活力测定方法及活力单位定义参照Koyama 等[14]的方法进行。在25℃条件下,以尿酸浓度120μmol/L1pH8.4,0.2mol/L硼酸缓冲液为反应底物,取3mL底物于4mL石英比色皿中,加入适量重组黑曲霉尿酸氧化酶粗酶液,充分混匀后准确读取293nm波长处反应5min起始和终止的光密度值,计算酶活力单位。活力单位定义:该条件下每分钟催化分解1μmol尿酸所需的酶量为1.0个单位(IU)。酶活性计算公式为:

IU/mL=(ΔA×VT×df)/(12.2×VE)。

式中,IU/mL为每mL尿酸氧化酶活力单位数；ΔA为25℃,反应5min,在293nm波长下光密度的下降值；VT为反应液总体积(mL)；df为稀释倍数；12.2为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数；VE为加入的粗酶体积(mL)。

蛋白含量测定用Bradford法进行。

7)rANUO的诱导表达产物的电泳检测 将5)中pH8.0的破菌液和离心后的上清液进行SDS-PAGE检测(15%)和非变性电泳(8%)检测,鉴定蛋白的表达量及分子量大小。

8)rANUO最佳作用温度测定 按照5)中pH8.0的磷酸缓冲液提取粗酶液的方法制备粗酶液,取1μL酶液,加到上述酶活性测定用底物液中,分别置于25、30、35、37、40、45℃水浴反应5min,测定A293光吸收值变化(ΔA293),将ΔA293值最大时的酶活力定义为相对活力100%,计算不同温度条件下的相对催化活力。

2　结果

2.1rANUO基因的RT-PCR扩增

rANUO基因的RT-PCR扩增产物的电泳检测结果见图1。由图可见基因扩增的DNA片段略小于1000bp,与引物设计产物的理论值920bp预期值相符。

图1　rANUO基因的RT-PCR扩增结果

2.2rANUO基因序列测定与分析

PCR产物与pMD18-Tvector连接后转化Trans1-T1PhageResistentChemicallyCompetentCell。将PCR鉴定正确的转化菌送交上海生物工程有限公司进行DNA序列测定。序列测定结果如下:

CCATGGGCTCTTCCCCAGTTACTGCGGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGAGTATACAAGGTCCACCGTG ATGAGAAGACCGGCGTCCAGACGGTCGTGGAGATGACCGTGTGCGTCCTTTTGGAGGGTGACATCGACACC TCCTACACCAAAGCCGACAACAGCGTCATTGTCGCAACCGACTCCATCAAGAACACCATCTACATCACCGCC AAGCAAAATCCCGTCACTCCCCCCGAGCTCTTCAGCTCCATTCTTGGAAGCCACTTCATCACCAAGTACAAC CACATCCACGCCGCCCATGTCAACATCATCACCCACCGCTGGACCCGTATGACCATCGACGGCAAGCCGCAC CCGCACTCCTTCCTCCGGGATGGCGAGGAAACCCGCAACGTGCAGGTCGATGTCGTCGAGGGCAAGGGTGT TGACATCACGTCGTCTCTGGCCAAGTTGACTGTGCTGAAGAGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTGC GCGACGAGTACACCACACTCCCTGAGACATGGGATCGTATTCTCAGCACCGATGTCGACGCCAGCTGGCAG TGGCGCCGGTTCAGCGGGCTGGACGAGGTGCGCGCTACTGTGCCTCATTTCGATGCGACCTGGGCGGCGGC CAGGGATATCACCCTTAAGACCTTTGCCGAGGACAACTCGGCTAGTGTGCAGAACACTATGTACAAGATG GCGGAGCAGATCCTGGCTCGTCAGTCCTTGCTCGAGACGGTCGAGTACTCTCTGCCTAACAAGCACTACTT TGAAGTTGACCTGAGCTGGCACAAGGGCCTGAAGAACACCGGCAAGGACGCTGAGGTGTATGCGCCGCAG ACCAACCCGAACGGGCTGATCAAGTGCACGGTTGGTCGCAACACGAAGGCGAAGCTGTAGAAGCTT

结果显示,除去人工加入的一组甘氨酸密码子外,rANUO基因cDNA的ORF全长909bp,编码302个氨基酸残基。经Blast检索,相似性最高的序列是AspergillusnigerCBS513.88,在GenBank上的注册号是XM_001399702,二者间的同源性为99%。在第22位氨基酸残基的密码子由CGC变为CGT,23位密码子由GAC变为GAT,30位密码子由ACA变为ACG,第36位密码子由GTC变为GTG,第52位密码子由GAT变为GAC,第63位密码子由AAA变为AAG,第277位密码子由GCC变为GCT,上述密码子的变异均未造成氨基酸编码的变化。但是,在第82位密码子由GGC变为AGC造成编码氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸；第215位密码子由GAA变为GAT造成编码氨基酸由谷氨酸变为精氨酸。根据编码氨基酸的变化,可以推断表达蛋白的水溶性会有轻微提高,编码蛋白的等电点也会稍有提高。

2.3rANUO的提取pH条件的选择与粗酶的活性测定结果

将经过诱导表达后的工程菌分别用不同pH (6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0)的缓冲液重悬湿菌体并进行超声波破菌,离心后取上清测定酶活性。结果见图2。由图2可见,rANUO在0.1M,pH8.0的磷酸缓冲液中活性最高。将诱导表达的工程菌湿菌体按照1∶20的比例重悬于pH8.0,0.1mol/L 的PB中,破菌后的上清蛋白含量约1.44mg/mL,酶活性为67.69IU/mL。比活力为47.0IU/mg。用pH7.4的磷酸缓冲液提取的粗酶活力为55.79IU/mL,达到了最高活力的82.4%。

图2　pH对rANUO溶解的影响

2.4SDS-PAGE电泳(15%)和非变性电泳(8%)检测rANUO表达蛋白

E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO诱导表达后的SDS-PAGE检测结果见图3。可见rANUO蛋白分子量在31～43kDa之间。推断实际单体酶的分子量应该35～37kDa之间。在表达产物的上清和全菌中都有十分明显表达蛋白条带。说明该表达蛋白能够很好的溶解在pH8.0,0.1mol/L的PB中。用BioRadGelDocXR凝胶成像分析系统中的QuantityOne1-D软件分析SDS-PAGE电泳图,结果显示rANUO表达量占全菌可溶蛋白总量的36.6%。未诱导工程菌上清蛋白中未检测出明显的表达蛋白条带。

非变性电泳(8%)检测结果见图4。由图可见,诱导后的E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO表达产物的上清和全菌中都有十分明显表达蛋白带,分子量大于130kDa且小于170kDa。推断该表达蛋白自我装配成4聚体蛋白。表观分子量应为140～150kDa。

图3　E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO表达产物的SDS-PAGE分析(15%)

图4　E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO表达产物的非变性电泳分析(8%)

2.5rANUO最佳酶促反应温度的测定结果

用pH8.0的0.1M磷酸缓冲液抽提rANUO,在不同温度条件下测定其在5min时间内相对催化活力,结果见图5。由图可见,在温度为35℃时相对活力最高,温度在30～40℃之间rANUO的差异并不大,但是在45℃有较大幅度的下降。

3　讨论

高尿酸血症和痛风是现代人类最常见的代谢病之一。在临床上,尿酸氧化酶可用于痛风、高尿酸血症和肿瘤溶解综合征等的治疗,还能用于血尿酸检测试剂盒的生产或制备。因此有较好理化性状且低成本的尿酸氧化酶的制备开发非常重要。在我们检索的文献中只有直接用天然黑曲霉制备尿酸氧化酶的报道[15],而未见用大肠杆菌工程菌制备尿酸氧化酶的文献。直接用黑曲霉制备尿酸氧化酶需要较长的培养时间,生产成本也相对较高。为此我们用本实验室分离的一株黑曲霉为模板克隆了尿酸氧化酶基因,并且构建了一个以大肠杆菌为宿主的高效表达工程菌。其构建过程和表达产物有如下特点。

图5　温度对rANUO活性的影响

构建之初我们用普通黑曲霉培养基进行黑曲霉培养、RNA提取和RT-PCR,但总是不能克隆出rANUO基因。以后我们设计了一个以尿酸为唯一氮源的培养基对黑曲霉进行培养,然后用此培养物进行总RNA提取和RT-PCR,成功克隆出了黑曲霉尿酸氧化酶基因。这说明尿酸氧化酶在这株黑曲霉中是一种完全靠诱导产生的酶。在有充足的其它氮源时尿酸氧化酶基因不被转录,只有当尿酸成为其唯一氮源时才得以转录。

该表达工程菌能高效表达尿酸氧化酶,其表达量占菌体可溶蛋白总量的36.6%。表达的rANUO 在pH8.0,0.1mol/L的PB中能很好的溶解并有较高的酶活力。以1∶20的质量/体积比进行菌体重悬和破菌后的粗酶液活力为67.69IU/mL,比活性为47.00IU/mg。因为破菌时的缓冲液体积相当于培养基体积的1∶10,所以本实验的表达菌活力相当于6.77IU/mL培养基。Ali等[15]用Aspergillusniger Thom&Raper1945株中制备的尿酸氧化酶活力为2.139IU/mL培养基,Aspergillusnigervan Tieghem1867菌株活力为2.456IU/mL。AliUF进行酶活力测定的温度为30℃,较本研究的25℃为高。因此,我们构建的表达工程菌的尿酸氧化酶得率至少要高1倍以上。文献报道的其它微生物来源尿酸氧化酶中,活性测定条件相同的有Koyama等[14]报道的产朊假丝酵母(Candidautilis)尿酸氧化酶的大肠杆菌表达工程菌。他们报道的尿酸氧化酶破菌粗提液的活力为6.1IU/mL培养基,比活力为25IU/mg,表达量为细胞可溶蛋白总量的20%。相比之下,本研究单位体积培养基生产的尿酸氧化酶总活力,比活力和目的蛋白表达量占可溶蛋白总量的比例都更高。本法制备的酶在pH7.4～8.0的条件下能较好的溶解。其溶解性状明显优于哺乳动物来源的尿酸氧化酶pH10以上的溶解pH[11]。

根据rANUO粗酶的SDS-PAGE和非变性电泳结果检测分析,可以推断rANUO是由4个分子量约为36kDa的单体聚合而成。其表观分子量为144kDa左右。

Ali等报道了用2株黑曲霉菌株直接生产尿酸氧化酶的最佳pH和最佳温度[15]。Aspergillusniger Thom&Raper1945株的最佳pH为9.0,最佳温度为45℃。AspergillusnigervanTieghem1867株最佳pH为8.0,最佳温度为35℃。本研究用基因工程菌表达rANUO,采用的生产条件等同于大肠杆菌的表达条件,也即pH7.0和37℃的培养条件。我们对表达出来的rANUO的最佳溶解pH和最佳酶促反应温度进行了测定。结果是rANUO的最佳溶解pH为8.0,相对活力最高的温度为35℃。该结果与AspergillusnigervanTieghem1867株的结果完全吻合。由此我们可以得出如下推断,不同黑曲霉菌株的尿酸氧化酶酶促反应特性不同。根据AliUF的报道,至少有2种不同的特性。本实验室分离的黑曲霉所表达的尿酸氧化酶与他们报道的AspergillusnigervanTieghem1867株有相似的生化特性。

总之,我们研究了1株黑曲霉尿酸氧化酶基因的克隆和原核表达,表达的rANUO有较好的理化形状和较高的生产率,为获得尿酸氧化酶提供了一个新的途径。

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[编辑] 方多

[作者简介]卢苇(1988—),女,硕士生,主要从事医药生物工程学习与研究工作;通信作者:荣俊,E-mail:496281344@qq.com。

[基金项目]国家自然科学基金项目(31570022)。

[收稿日期]2015—11—12

[中图分类号]R34

[文献标志码]A

[文章编号]1673—1409(2016)06—0001—06