一种安徽产野生铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其组织分布

郁　阳，梁益敏，麻兵继，王国凯，刘劲松，李守婷，王　刚

(1.安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 　230012；

2.河南农业大学农学院，河南 郑州　450002)



一种安徽产野生铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其组织分布

郁阳1，梁益敏1，麻兵继2，王国凯1，刘劲松1，李守婷2，王刚1

(1.安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；

2.河南农业大学农学院，河南 郑州450002)

摘要：目的分离鉴定安徽地区野生铁皮石斛内生真菌，旨在丰富其内生真菌资源种类。 方法通过组织块法对内生真菌进行分离，运用形态学和分子生物学方法进行鉴定。结果从中分离得到11株内生真菌，鉴定为5属11种。 结论铁皮石斛内生真菌种类资源广泛分布，为研究其与宿主石斛共生关系提供理论依据。

关键词：铁皮石斛；内生真菌；分离；鉴定

石斛为常用中药，历代本草多有收载。商品包括霍山米斛、金钗枫斗、铁皮枫斗，铜皮枫斗，黄草石斛等[1]。铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草被植物，具有生津养胃，滋阴清热，润肺益肾，明目强身等功效，现代药理研究表明其具有抗肿瘤，抗氧化，增强人体免疫力和降低血糖等作用，《道藏》中将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首[2-3]。野生的铁皮石斛大多分布在东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区。中国铁皮石斛主要分布于浙江、广西、广东、福建、湖南和贵州等地[4]。铁皮石斛的种子极小、无胚乳，很难用实生苗栽培，而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为的过度采挖和破坏生态环境，其资源已濒临灭绝，因而被国家列为重点保护的药用植物之一[5]。

在自然条件下铁皮石斛种子的萌发依靠真菌诱导，目前有相关学者从不同生态环境下的铁皮石斛中分离得到多种内生真菌，并对其促生长作用进行初步研究。赵昕梅等[6]从河南产野生铁皮石斛中分离得到4株内生真菌，其中一种镰刀属菌株对铁皮石斛的生长促进作用明显，成活率提高30.43%，植株高度增加了31.21%，鲜质量增加40.61%。侯晓强等[7]、胡克兴等[8]从云南产野生铁皮石斛中分离得到67株内生真菌，并对其中36株进行促生长作用筛选，结果发现，Pestalotiopsis、Eurotium、Pyrenochaeta、Coprinellus、Pholiota、Alternaria、Helotiales这七属8株内生真菌均能侵染铁皮石斛根，在铁皮石斛根的根被、外皮层、皮层中以菌丝或菌丝团的形式存在，对铁皮石斛苗有促生长作用。吴慧凤等[9]从湖南产野生铁皮石斛中分离得到37株内生真菌，过与组培苗共生筛选，获得9株促生菌，其中Epulorhiza、Mycosphaerella、Guignardia这三属3株真菌对铁皮石斛的鲜质量增长率、根数增长率和芽数的促生效果最好。

虽然上述学者对主要产地野生铁皮石斛内生真菌促生长作用进行初步研究，但促生真菌的种类都不相同，说明不同生态环境下，铁皮石斛与之共生的内生真菌种类有差异，且上述对安徽地区野生铁皮石斛的研究还未曾报道。本文报道安徽产铁皮石斛内生真菌对其促生长作用、抗逆性以及有效成分的积累等一系列相关性研究，并对安徽产野生石斛内生真菌进行分离鉴定，旨在探索不同生境下铁皮石斛内生真菌种类多样性，寻找更适合促进安徽地区铁皮石斛栽培繁殖的内生真菌，有利于安徽产铁皮石斛资源的保护和人工栽培。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试品样品野生铁皮石斛健康植株于2015年7月29号采自安徽省池州市石台县仙寓镇奇峰村(东经117°25′56.13″，北纬30°03′36.66″，海拔195 m)，经安徽中医药大学方成武教授鉴定为兰科石斛属铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)。

1.1.2分离纯化培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉18 g、蒸馏水1000 mL)。

1.1.3仪器与试剂JJ-CJ-2FD洁净工作台(吴江市净化设备总厂)；MIKRO 22R高速冷冻离心机(德国Hettick公司)；SHP-250型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂)；T-Gradient Thermoblock PCR仪(德国Biometra公司)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)；通用引物ITS( Internal transcribed spacers )1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)由上海生工生物工程股份有限公司定制。

1.2方法

1.2.1内生真菌的分离和纯化取健康无病害野生铁皮石斛完整植株，用自来水冲洗干净，取其须根和腐叶，吸干表面水分之后，进行常规表面消毒[10]：先用75%乙醇消毒30 s，接着使用有效氯为1%次氯酸钠消毒1～3 min，再用75%乙醇消毒1～2 min，最后用无菌水冲洗2～3次，吸干表面水分，取最后一次无菌水200 μL涂布于PDA培养基中，平行3份，做为空白对照。倒置于恒温培养箱中，28℃避光培养3～5 d，要求对照平板无菌落生成，确保表面灭菌彻底。取表面消毒后的植株，用灭菌刀片将植株的根、茎切成0.2 cm的小段；用无菌剪刀将叶剪成0.1 cm×0.1 cm的小块，接于PDA培养基中，每个平板接3～5块/段，平行3份，倒置在恒温培养箱中，28℃避光培养5～15 d。观察培养皿中材料切口处长出菌丝(菌落)，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别用无菌牙签挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的PDA培养基中，按上述培养条件继续培养2～3代，确保所得菌为纯菌。

1.2.2内生真菌形态学鉴定参考文献方法[11]，根据所分得的真菌菌落培养特征、菌丝形态，产孢结构类型以及孢子的形态、颜色、大小进行初步鉴定分类。

1.2.3内生真菌分子鉴定(1)内生真菌DNA提取：将纯化好的菌株接种于PDA平板上，28℃避光培养5～7 d。待平板上长满菌丝后，用灭菌的刮刀刮取菌丝体于灭菌的研钵中。参照真菌基因组DNA小量提取试剂盒步骤进行操作得到DNA溶液，置于-20℃冰箱中保存、备用。

(2)rDNA-ITS的PCR扩增：扩增真菌rDNA-ITS序列引物为：

上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反应体系50 μL，见表1。

表1　PCR扩增rDNA-ITS的反应体系

PCR扩增程序(每份扩增产物平行3份)：预变性95℃，5 min，变性95℃，1 min，复性49℃，1 min，延伸72℃，2 min，30个循环，最后延伸72℃，10 min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，1×TAE电泳缓冲液，以100 V电压电泳约40 min，EB染色5 min，由凝胶成像系统进行观察，拍照。检测后置于-20℃冰箱中保存、备用。

(3)内生真菌rDNA基因的系统发育分析：将PCR扩增产物交由华大基因科技有限公司进行测序，测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析，采用分子进化遗传分析软件MEGA ver.5.0构建系统发育树。其中系统进化矩阵按Kimura 2-Parameter模型估算，采用邻接法聚类分析构建系统发育树，重复取样1 000次进行自展值分析评估系统进化树拓扑结构的稳定性，再结合序列对比，对菌株进行鉴定。

2结果

2.1内生真菌分离通过组织分离法从铁皮石斛中分离得到11株，从石斛根中分离得到4株，茎中分离得到2株，叶中分离得到5株，具体结果见表2。

表2　铁皮石斛内生真菌分离株数

2.2形态学鉴定分离得到的内生真菌通过菌落特征和显微观察，如内生真菌的TPSH07，菌株TPSH07表面菌丝灰褐色，茂密，泡状突起，菌丝团薄壁组织，分生孢子子梗单一，不分枝，刚毛黑色，稀少，围生；显微下菌丝细长，呈辐射状分布。按照魏景超[11]编著的《真菌鉴定手册》(第一版)初步认为菌株TPSH07为刺盘孢属(Colletotrichum)真菌。形态和显微结构见图1。

TPSH0740×

图1内生真菌TPSH07的显微结构

2.3分子学鉴定

2.3.1PCR扩增产物电泳结果对分离得到的内生真菌提取DNA，得到DNA提取液，进行rDNA-ITS序列扩增，在550 bp左右处出现一条单一明亮的条带，部分内生真菌DNA扩增产物电泳结果见图2。

图2　部分内生真菌16SrDNA的

2.3.2rDNA-ITS序列比对以及系统发育树的构建登陆NCBI网站，将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析，具体结果见表3。

表3　内生真菌分子鉴定序列比对表

对比分离得到的11株内生真菌与其同源性相似的11株已知菌种的16SDNA序列，利用MEGA5.0和Clustal X软件构建系统发育树，结果见图3。

图3　邻接法构建内生真菌ITS序列系统发育树

由表3和图3可知，安徽产野生铁皮石斛的内生真菌分布在5个属中，其种类资源广泛。从铁皮石斛中分离得到的内生真菌主要分布在Colletotrichum属中，占其总数的54.5%，为其优势种群。此外，在安徽产铁皮石斛中分离得到的Cosmospora和Deniquelata属真菌在前人学者研究的铁皮石斛中未发现，拓展了不同生境下铁皮石斛内生真菌的种类资源。

3讨论

本文研究安徽产野生铁皮石斛，从中分离得到11株内生真菌，其中从叶和根中分离得到的真菌占总数的82%，主要分布在Colletotrichum属中，因此Colletotrichum属为安徽产野生铁皮石斛的内生真菌的优势种群，且从中分离的Cosmospora和Deniquelata属真菌未曾在其他地区野生铁皮石斛相关文献中报道[6-9]，这不仅丰富了不同产地铁皮石斛内生真菌的种类资源，也扩展了石斛属内生真菌的种类资源。

自然条件下，内生真菌对石斛属植物，尤其是濒临灭绝的药用石斛来说是不可或缺的物质，它是在石斛药材的人工栽培、资源保护和再生环节中的关键限制性因子[12]。石斛属植物内生真菌与宿主石斛之间共生关系主要表现在石斛菌根和组培苗形成的过程中，周玉杰等[13]从华石斛中分离得到5株内生真菌，将其接种于接种华石斛组培苗和盆苗，结果表明真菌能够成功侵入华石斛根内形成菌根，不同程度地提高华石斛幼苗成活率，并能提高华石斛幼苗叶绿素含量、净光合速率和气孔导度，进而提高其光合性能。此外，内生真菌还能提高石斛属中有效成分的含量，尤其是多糖和生物碱含量。陈晓梅等[14]将纯化的菌根真菌分别与金钗石斛无菌苗共生培养，结果发现MF15、MF18、MF23和MF24分别可使金钗石斛多糖含量提153.4%、52.1%、18.5%、76.7%，MF23使金钗石斛总生物碱含量提高18.3%。因此，本文从安徽产野生铁皮石斛中分离鉴定内生真菌，结合其他学者从不同产地和生境铁皮石斛中分离得到的真菌，是研究石斛属内生真菌多样性的前提，也为后期研究单菌株以及多菌株协同作用于宿主石斛提供理论依据，以提高安徽产铁皮石斛药材栽培的生产效率，同时对内生真菌的次生代谢产物进行检测和分离，筛选出能产生和宿主石斛相同的或相似的生理活性物质的菌株，丰富了安徽产铁皮石斛药材的药用资源，提高了药用价值，为后期研究内生真菌与安徽地区铁皮石斛药材品质之间的相关性提供思路。

鉴于中药石斛目前是我国珍稀频危的药材品种，因此，积极研究其内生真菌的生态状况，对揭示环境条件对药材道地性形成的重要影响及资源的有效利用与开发，都有着重要意义。

参考文献：

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[2]方香香,张寿文.铁皮石斛内生真菌研究进展[J].中国现代中药,2014,16(5)：419-422.

[3]李昊.铁皮石斛内生真菌的研究进展[J].安徽农业科学，2013，41(8)：3377-3378.

[4]柳莲芳.铁皮石斛的最新研究进展[J].安徽农业科学，2012，40(11)：6426-6428.

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[6]赵昕梅,远凌威,张苏锋,等.铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其促宿主生长作用[J].河南农业科学，2012，41(6)：101-105.

[7]侯晓强,郭顺星.铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定[J].中国中药杂志,2014,39(17)：3232-3237.

[8]胡克兴,侯晓强,郭顺星,等.铁皮石斛内生真菌分布[J].微生物学通报，2010,37(1)：37-42.

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[11] 魏景超.真菌鉴定手册[M].北京：科学技术出版社，1979.

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Isolation and identification of endophytic fungi from Anhui wild Dendrobium officinale and their distribution in different tissues

YU Yang1,LIANG Yi-min1,MA Bing-ji2,et al

(1.SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryforModernChineseMateriaMedica,Hefei,Anhui230012,China；2.CollegeofAgronomy,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China)

Abstract:Objective To isolate and identify the endophytic fungi from Anhui wild Dendrobium officinale to enrich the types of resources in the endophytic fungi.Methods The endophytic fungi were isolated from root,stem and leaf of the cultivated Dendrobium officinale by tissue inoculation culture,respectively,and then were identified by morphology and rDNA sequence analysis.Results 11 strains from the cultivated Dendrobium officinale were identified as 11 species and 5 genera. Conclusions Endophytic fungi exist richly in Dendrobium officinale,which provides theoretical basis for the research on the symbiotic relationship between the Dendrobium officinale and endophytic fungi.

Key words:Dendrobium officinale；endophytic fungi；isolation；identification

(收稿日期：2015-10-12，修回日期：2015-11-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.006

作者简介：郁阳，男，硕士研究生通信作者：王刚，男，教授，硕士生导师，研究方向：天然药物活性成分研究，E-mail：kunhong_8@163.com

基金项目：国家中医药管理局“中药化学”重点学科建设(No 2012-2017)