HPLC测定注射用奥沙利铂的含量及有关物质

陈传喜，杨志勇，袁　红，王继平，王大荣

(黄冈市中心医院肿瘤科，湖北 黄冈　438000)



◇药物分析◇

HPLC测定注射用奥沙利铂的含量及有关物质

陈传喜，杨志勇，袁红，王继平，王大荣

(黄冈市中心医院肿瘤科，湖北 黄冈438000)

摘要：目的建立注射用奥沙利铂含量及有关物质的HPLC方法。方法含量和有关物质测定以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂Zorbax Rx-C(18)(4.6 mm×250 mm)5 μm，以磷酸溶液(取10%磷酸溶液0.6 mL，加水稀释至1 000 mL，用氢氧化钠溶液或磷酸调节pH值至3.0)—乙腈=99∶1为流动相，流速0.8 mL·min(-1)，检测波长209 nm，进样量20 μL。 结果奥沙利铂在6～16×10(-3) g·L(-1)浓度范围内线性关系良好，检测限为0.02%，回收率为100.55%(RSD=0.46%)，测定样品含量为99.8%，有关物质均小于0.5%。结论该方法快速，专属性强，灵敏度高，重现性好，可作为注射用奥沙利铂的含量及有关物质的检测方法。

关键词：注射用奥沙利铂；HPLC法；含量；有关物质

注射用奥沙利铂是第三代铂类抗癌药物，临床用于治疗晚期结、直肠癌，对顺铂耐药的肿瘤细胞也有一定作用，且毒副作用比顺铂小[1]，与传统化疗药物或紫杉类药物间不具交叉耐药性[2-3]。注射用奥沙利铂(商品名：乐沙定RR)由瑞士Debiopharm公司研制开发生产，规格为50 mg，于1996年首次在法国上市，现已经在欧盟、美国及我国等多个国家和地区上市多年，临床应用广泛。铂类药物是晚期癌症的首选方案，但是早期开发的顺铂和卡铂具有明显的交叉耐药性。奥沙利铂含有DACH基团空间位阻作用较强，作用机制与顺铂类似，与其他抗癌药物联合使用无交叉耐药性，能有效避免上述缺点。该药的分子式为C18H14N2O4Pt，分子量397.29，化学名为 (1R-反式)-(1,2-环己二胺-N,N’)[草酸(2-)-O,O’] 合铂。美国药典收载了注射用奥沙利铂的质量标准[4]，中国药典、英国药典等均未收载注射用奥沙利铂的质量标准，国内原有质量标准WS1-(X-090)-2003Z是为奥沙利铂的无菌冻干品或奥沙利铂与乳糖的无菌冻干品制定，但研究发现此方法不能将有关物质中的单杂进行控制。本文通过对现有HPLC的条件进行优化，得到快速、准确的测定注射用奥沙利铂含量及有关物质的方法。

1仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪，配紫外检测器(Agilent)及安捷伦色谱工作站，电子分析天平(AE240 梅特勒-托利多仪器有限公司)，HDC-S超声仪(济宁亨达超声设备有限公司)。色谱纯乙腈(色谱纯，TEDIA公司生产)，纯化水，氢氧化钠(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。奥沙利铂标准品(中国药品生物制品检定所，批号100584-201408)，注射用奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：14082247，14082547，14092147，规格50 mg)。

2方法和结果

2.1色谱条件 色谱柱：Zorbax Rx-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：磷酸溶液(取10%磷酸溶液0.6 mL，加水稀释至1 000 mL，用氢氧化钠溶液或磷酸调节pH值至3.0)∶乙腈=99∶1为流动相，流速0.8 mL·min-1，检测波长209 nm，进样量20 μL；柱温：30℃。

2.2溶液配制

2.2.1含量测定对照品溶液精密称取经105℃干燥至恒重的奥沙利铂对照品25 mg，置250 mL容量瓶中，加适量纯化水溶解后，定容至刻度，摇匀，配制成浓度为0.1 g·L-1的对照品溶液，备用。

2.2.2含量测定供试品溶液取供试品注射用奥沙利铂适量(相当于奥沙利铂25 mg)，置250 mL容量瓶中，加适量纯化水溶解后，定容至刻度，摇匀，配制成浓度为0.1 g·L-1的供试品溶液，备用。

2.2.3有关物质测定供试品溶液称取“2.2.2”项中注射用奥沙利铂的粉末适量，精密称定，置于50 mL的容量瓶中，加入适量蒸馏水溶解，补加蒸馏水定容，摇匀。配制成1 mL中含有约0.01 mg奥沙利铂的溶液。

2.2.4有关物质对照溶液精密量取“2.2.3”项中的有关物质供试品溶液1 mL，置于100 mL的量瓶中，加入纯化水定容至刻度，摇匀。

2.2.5阴性对照溶液称取甘露醇100 mg、置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，滤过，取适量，稀释与样品相同倍数，即得空白辅料溶液。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验取“2.2.1”项下奥沙利铂对照品溶液1 mL，置于100 mL的容量瓶中，加入纯化水定容至刻度，充分振摇溶解，精密量取 20 μL进色谱仪，按照上述色谱条件测定，记录色谱图。按照上述方法分别取“2.2.2”项下含量供试品溶液、 “2.2.3”项有关物质供试品溶液、“2.2.4”项有关物质对照溶液及“2.2.5”空白辅料溶液各1 mL，稀释至同等浓度，进色谱仪测定，记录色谱图，结果辅料峰未干扰测定(图1)。

图1　HPLC色谱图

注：A.含量测定对照品溶液；B.含量测定供试品溶液；C.有关物质测定供试品溶液；D.有关物质对照溶液；E.阴性对照溶液。

再分别取注射用奥沙利铂适量，研细，精密称量粉末(约相当于主药10 mg)进行如下测试：(1)酸破坏：将精密称定后的粉末置具塞试管中，加入0.1 mol·L-1盐酸溶液25 mL，摇匀，置于100℃水浴锅中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1氢氧化钠中和并转移至100 mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度为0.1 g·L-1的溶液，摇匀，过滤。(2)碱破坏：将精密称定后的粉末置具塞试管中，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液25 mL溶解，摇匀，置于100℃水浴锅中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1盐酸中和并转移至100 mL的容量瓶中，用流动相稀释，配制成浓度为0.1 g·L-1的溶液，摇匀，过滤。(3)氧化破坏：将精密称定后的粉末置具塞试管中，加入30%过氧化氢溶液10 mL，摇匀，放置12 h，加水稀释至刻度，配制成浓度为0.1 g·L-1的溶液，摇匀，过滤。(4)加热破坏：将精密称定后的粉末置具塞试管中，加水稀释，配制成浓度0.1 g·L-1的溶液25 mL，置于100℃水浴锅中4 h，放冷，过滤。(5)光破坏：将精密成定后的粉末置具塞试管中，加水稀释，配置成0.1 g·L-1溶液25 mL，置于强光(5 000 Lx)下照射12 h后，放冷。按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图。结果显示样品在经过酸、碱、氧化、加热、光照破坏后主成分与各降解产物可以达到很好的分离(图2)。

图2　降解产物测试HPLC图

注：F.样品酸破坏图谱；G.样品碱破坏图谱；H.样品氧化破坏图谱；I.样品加热破坏图谱；J.样品光照破坏图谱。

2.3.2系统适用性试验分别精密量取“2.2.1”项中奥沙利铂对照品溶液、“2.2.2”注射用奥沙利铂供试品溶液及“2.2.5”项阴性对照溶液20 μL，按照上述色谱条件进样，色谱柱的理论塔板数按照奥沙利铂计算不得少于2 000，奥沙利铂与相邻杂质峰的分离度不低于2.0。

2.3.3检测限测定取“2.2.1”项中配制的奥沙利铂对照溶液，稀释至50×10-3g·L-1，按照上述色谱条件进样，根据信噪比法进行试验，得到的结果：最小检出量为4×10-6mg(S/N=3)，检出限为0.02%。

2.3.4线性试验精密称量奥沙利铂对照品25 mg，置于25 mL的容量瓶制备成浓度为1.0 g·L-1的溶液，依次精密吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL，分别置于100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得到浓度依次为6.00，8.01，10.01，12.02，14.02，16.02×10-3g·L-1浓度的溶液，按照上述色谱条件取20 μL依次进样，记录色谱图。以奥沙利铂峰面积Y为纵坐标，以进样浓度X为横坐标，得到线性回归方程为：Y=0.170 1X+0.141 4，r=0.999 8，表明奥沙利铂在6.00～16.02×10-3g·L-1浓度范围内呈现良好的线性关系，结果见图3。

图3　奥沙利铂线性关系图

2.3.5精密度及重复性试验取“2.2.1”项下奥沙利铂对照溶液，按照上述色谱条件进样，重复测定6次，记录奥沙利铂的峰面积，计算相标准偏差RSD=0.39%，说明仪器精密度良好。此外，取14082247批次的注射用奥沙利铂，精密称量适量的粉末(相当于主药50 mg)，加水稀释，配制成浓度为1 g·L-1供试品溶液6份，按照上述色谱条件在同一高效液相色谱仪上分别进样，记录奥沙利铂面积，其含量平均值为99.78%，相对标准偏差RSD=0.42%，显示重现性良好。

2.3.6回收率试验按照处方比例称量适量的辅料，(相当于1瓶制剂的辅料量)，分别加入处方量的80%，100%，120%的奥沙利铂的对照品，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，每个含量的溶液分别取3份1 mL加流动相稀释至10 mL作为供试品溶液。精密量取20 μL溶液，按照上述色谱条件进液相仪，记录图谱，结果见表1。计算得平均回收率为100.55%，RSD=0.46%。

表1　加样回收率数据

2.3.7溶液稳定性试验取供试品溶液，分别在0、6、12、18、24 h精密吸取20 μL进样，记录色谱图，得出峰面积分别为19021、19214、19321、19330、19610，平均峰面积19226，计算其相对标准偏差RSD为0.65%，说明奥沙利铂在24 h内溶液稳定。

2.4样品测定

2.4.1有关物质测定取上市品注射用奥沙利铂1瓶，精密称量适量粉末(相当于奥沙利铂50 mg)，置于50 mL的容量瓶中，加水振荡溶解，补加水稀释至刻度，摇匀，过滤，滤液作为供试品。取“2.2.1”项中奥沙利铂对照溶液，稀释与供试品同等浓度作为对照溶液。精密量取供试品和对照品溶液20 μL进高效液相色谱仪，记录色谱图。根据面积归一化法计算有关物质的峰面积。按照上述方法分别测定3批上市品(批号：14082247，14082547，14092147)中有关物质测定结果分别为0.35%，0.33%，0.36%。

2.4.2含量测定取上市品注射用奥沙利铂1瓶，精密称量适量粉末(约相当于主药10 mg)，置于100 mL的容量瓶中，加水溶解，补加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品。取“2.2.1”项中奥沙利铂对照溶液稀释与供试品同等浓度作为对照溶液。精密量取20 μL对照品与供试品溶液，进高效液相色谱仪，记录图谱。按照外标法分别测定3批上市品(批号：14082247，14082547，14092147)中含量分别为99.8%，99.9%，99.8%。

3讨论

在对上市品有关物质及含量方法学的研究过程中[5-6]，按照国内药品标准[7]研究发现此条件不能有效的将有关物质进行分离，分离度不足1.5，不能作为检测有关物质的条件进行测定。

本研究通过调整流动相的比例和流速，尝试使用Alltima-C18、Zorbax Rx-C18、HP-35-C18柱在分离度、理论塔板数、拖尾因子等方面综合考量，Zorbax Rx-C18柱具有能有效分离奥沙利铂的有关物质草酸及其他杂质，出峰时间合理。另外通过专属性研究酸、碱、高温、氧化破坏的杂质及对照品最大的吸收峰均在209 nm，此波长可以将主成分及有关物质较为灵敏的检测出。

通过测定的结果显示在以下条件：磷酸溶液(1 mL磷酸，加水至1 000 mL即得)—乙腈(99∶1)；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：209 nm；进样量：20 μL；柱温：30℃，主峰和辅料、有关物质达到基线分离要求，色谱峰形对称符合检测要求。

参考文献：

[1]王彦美,韩杰,周邵兵,等.铂抗癌药物研究进展[J].合成化学,2003,11(1):27-31.

[2]张文.晚期结直肠癌的化疗进展[J].中国癌症杂志,2004,14(4):380.

[3]杨柳青,秦叔逵.第3代铂类药物洛铂的研究新进展[J].临床肿瘤学杂志,2009,14(12)：1134-1139.

[4]United States Pharmacopoeia(31)[S],2015:2696.

[5]徐静,张伟明,李健和,等.奥沙利铂静脉输液的有关物质检查与含量测定[J].中国药业，2013,22(15):48-50.

[6]闫占宽,李语如,宋晓光,等.高效液相色谱法测定奥沙利铂注射液中奥沙利铂的含量和有关物质[J].东华理工大学学报,2010,33(3):290-292.

[7]国家药品标准. 注射用奥沙利铂药品注册标准[S]，2003.

Determination of content and related substances of Oxaliplatin for Injection by HPLC

CHEN Chuan-xi,YANG Zhi-yong,YUAN Hong,et al

(DepartmentofOncology,HuanggangCentralHospital,Hubei438000,China))

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method to determine the oxaliplatin content and the related substances of oxaliplatin for injection. Methods The chromatographic separation was performed on Zorbax Rx-C(18)(4.6 mm×250 mm，5 μm)that was made by alkyl-bonded silica gels,phosphoric acid solution(10% phosphoric acid solution 0.6 mL,diluted with water to 1 000 mL,pH adjusted to 3.0 with sodium hydroxide solution or phosphoric acid)- acetonitrile=99∶1; the flow rate was 0.8 mL·min(-1);the detection wavelength was 209 nm; the sample size was 20 μL.Results The linear of oxaliplatin was 6～16×10(-3) g·L(-1). The limits of detection was 0.02%. The average recovery was 100.55%(RSD=0.46%). Determination of the sample average content was 99.8%,and the related substance was less than 0.5%.Conclusions The method is rapid,specific,sensitive,and well repeatable,which can be used to determine the content of oxaliplatin for injection and its related substances.

Key words:oxaliplatin for injection;HPLC;content;related substance

(收稿日期：2015-10-23，修回日期：2016-01-18)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.012