人工培育冬虫夏草分生孢子的研究

李玲玲，罗合春，胡敏（重庆工贸职业技术学院生物化学工程系，重庆408000）



人工培育冬虫夏草分生孢子的研究

李玲玲，罗合春，胡敏
（重庆工贸职业技术学院生物化学工程系，重庆408000）

摘要：通过单因素试验和正交试验对冬虫夏草产分生孢子培养基进行优化，同时探讨培养条件（温度、光照和pH）对分生孢子产量的影响，确定冬虫夏草菌产分生孢子的最佳条件。结果显示：最佳的冬虫夏草产孢子培养基组成为：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，ZnCl20.09 g，组氨酸0.3 g，赖氨酸0.3 g，纯牛奶200 mL，超纯水补充至1 000 mL。最佳培养条件为：14℃、pH5.80、完全黑暗的环境下，培养40 d。在最佳培养基和最佳培养条件下，冬虫夏草单菌落分生孢子产量达到2.98×105个，优化后孢子产量是基础培养基孢子产量的3.6倍，明显提高了分生孢子的产量。

关键词：冬虫夏草；分生孢子；培养基优化

冬虫夏草在我国有着悠久的药用历史，记载可追溯到一千年之前[1]。其有效成分主要有：核苷类化合物，氨基酸、多肽，多糖类，糖醇、甾醇类，脂肪酸、酯、烷烃，多胺类物质，多种维生素等。具有免疫调节，保护肾脏、肝脏，抗菌、抗病毒、抗肿瘤，调节心血管、呼吸系统、造血系统功能，抗衰老、抗疲劳，降血糖等作用[2]。因此随着人们生活水平的提高，对冬虫夏草的需求越来越高，但天然冬虫夏草由于生长条件特殊，产量低，再加上人们的过度采集，使得虫草资源已经濒临灭绝。冬虫夏草人工培育成为解决这一问题的有效途径之一。

国内关于冬虫夏草人工培养进行了一些研究[3-8]，这些研究主要集中在如何通过液体发酵和固体发酵的方法提高其菌丝体或活性成分的产量，关于冬虫夏草分生孢子的研究也有报道，有人研究了不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的影响[9]，发现冬虫夏草真菌在玉米粉琼脂培养基、麦麸培养基、小麦培养基产生分生孢子较多，同时温度在15℃～18℃，完全黑暗条件下分生孢子产生较多。王灿研究了不同的温度条件下中国被毛孢分生孢子的形成数量和时间的变化，确定了产生分生孢子数量最大的时间是培养30d[10]。此前课题组已经研究了不同微量元素和生长因子对冬虫夏草分生孢子产量的影响[11]，在此基础上进一步研究碳源、氮源、添加物对冬虫夏草分生孢子产量的影响，确定最佳碳源、氮源和添加物，并试图通过正交试验，确定最佳的冬虫夏草产孢子培养基，为筛选冬虫夏草产孢子培养基提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1菌种

冬虫夏草菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2接种与培养

用灭菌的手术刀将冬虫夏草菌落边缘灰白色部分切割成约2 mm的菌块；用无菌接种铲将切好的菌块分别接种在各种平板上，每个平板接种5块，封口膜封住培养皿。

接种后的平板放于培养箱培养，培养条件：完全黑暗、18℃，培养过程中定期观察生长情况，培养一段时间后，观察菌落形态、量取菌落直径，并在光学显微镜下观察分生孢子形态。

1.3分生孢子的收集及计数

在每一平板中加入20 mL 0.1 %的吐温80溶液，用接种环轻轻刮取菌落上的分生孢子，收集于离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清，用1 mL 0.1 %的吐温80溶液将孢子制成悬液，涡旋振荡仪充分振荡，血球计数板计数单菌落产生的孢子数，4次重复。

1.4单因素试验

基础培养基配方：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，纯牛奶200 mL，补充超纯水至1 000 mL，初始pH5.60～6.00。

在基础培养基配方的基础上，分别改变碳源、氮源、添加物，添加不同的微量元素和氨基酸，每1 000 mL培养基中，改变碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖各30 g；改变氮源：蛋白胨、酵母粉、麸皮、蚕蛹粉、鱼粉各10 g；改变添加物：马铃薯200 g、鲜牛奶200 mL、无添加物牛奶和马铃薯；

添加微量元素：基础培养基中分别添加0.001 %不同种类的微量元素，4种微量元素分别为：CuSO4· 5H2O，FeSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，ZnCl2；

添加氨基酸：在基础培养基中分别添加0.01 %不同种类的氨基酸，8种氨基酸分别为：赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸。为防止氨基酸失活，培养基配制时，基础培养基和氨基酸溶液分开灭菌，基础培养基采用1×105Pa灭菌30 min；1 %氨基酸溶液采用过滤的方法灭菌，然后按照一定比例在基础培养基中分别添加8种过滤好的氨基酸溶液，使氨基酸在培养基中的含量达到0.01 %。

每个处理3个培养皿，将冬虫夏草菌块接种在不同处理的培养基上后，置于完全黑暗、18℃的恒温培养箱培养40 d，测定分生孢子产量。

1.5数据分析

单因素试验得到的数据采用Excel 2007和统计软件DPS7.01中的新复极差法分析数据间的差异显著性。

1.6正交试验

根据单因素试验结果，选取能明显促进分生孢子产量提高的无机盐和氨基酸，设计四因素三水平进行正交试验复选，确定最佳产分生孢子培养基配方。

1.7收获时间的确定

正交试验的过程中，研究分生孢子产量随时间变化的情况。在1号～9号处理的培养基上接种冬虫夏草菌块，在完全黑暗、18℃的环境下，分别培养至不同的天数，检测分生孢子产量，每次检测3个培养皿，3次重复。

1.8培养条件的优化

1.8.1培养温度对产孢水平的影响

按照正交试验得到的最优培养基配方配制培养基，调节初始pH为5.80，灭菌后接种冬虫夏草菌块，在完全黑暗的条件下，分别放于18、14℃培养，每个处理3个培养皿，培养至40 d时，检测分生孢子产量。

1.8.2初始pH对产孢水平的影响

用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调配最优培养基的pH，分别以4.60、5.20、5.80、6.40、7.00 5个不同初始pH作处理，在14℃、完全黑暗的条件下培养40 d，检测分生孢子产量。

1.8.3光照对产孢水平的影响

采用正交试验得到的最优培养基配方，调节初始pH 5.80，在14℃条件下，设12 h/12 h（光照/黑暗）交替培养、连续24 h黑暗培养2个处理，培养40 d，明确光照是否对产孢水平有影响。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

对各处理培养基上的分生孢子进行计数，数据采用Excel 2007和统计软件DPS7.01中的新复极差法进行差异显著性分析，结果见表1。

表1各单因素对冬虫夏草分生孢子产量的影响Table 1 The effect of different single-factor on the conidia production

续表1各单因素对冬虫夏草分生孢子产量的影响Continue table 1 The effect of different single-factor on the conidia production

不同氮源之间和不同氨基酸之间分生孢子产量差异极显著，酵母粉为氮源时单菌落分生孢子产量最高；添加了组氨酸的基础培养基，分生孢子产量最高，其次是赖氨酸。不同微量元素之间分生孢子产量差异显著，研究中选取了FeSO4·7H2O和ZnCl2两种无机盐用于正交试验。不同碳源之间和不同添加物之间分生孢子产量无显著性差异，研究中选择了孢子产量稍高于其它两种碳源的葡萄糖作为碳源；考虑到使用上的方便，选择了纯牛奶作为添加物。

2.2培养基优化的正交试验结果

选取能促进分生孢子产量提高的无机盐FeSO4· 7H2O、ZnCl2和生长因子组氨酸、赖氨酸4个因素，设计L9（34）正交表，因素水平见表2。

表2冬虫夏草产分生孢子培养基正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of L9（34）for the culture medium of the conidia by orthogonal experiment

在基础培养基中添加不同组合的4种组分，配制成9种不同的培养基，每种培养基3个培养皿，培养40 d，计数分生孢子产量，结果见表3、表4。

由表3可以看出，培养基中4种组分含量的不同对分生孢子产量有一定的影响，其中组合A3B3C2D1（即9号处理）的单菌落分生孢子产量最高。同时从表3也可以看出，菌落直径和孢子产量之间不呈正比关系，菌落直径大的不一定比菌落直径小的分生孢子产量高。由此说明，促进菌丝生长的组分与促进孢子产生的组分不太一样。

表3 L9（34）正交试验方案及结果Table 3 L9（34）orthogonal test and results

表4极差分析Table 4 Range analysis of orthogonal experiment

从表4极差分析结果可以看出，对分生孢子产量影响大小的顺序是ZnCl2＞FeSO4·7H2O＞赖氨酸＞组氨酸，对菌落直径影响大小的顺序是FeSO4·7H2O＞赖氨酸＞ZnCl2＞组氨酸，4种因素对二者影响大小不太一致。但总体上来看，微量元素比氨基酸对分生孢子产量和菌落直径影响要大，是主要因素。同时得到有利于分生孢子产量提高的最优组合为A2B3C2D2，此最佳培养基组合并不在实施的9个处理中（表3）。为了考察最优条件的再现性，须进行验证试验。

将培养基最优组合A2B3C2D2和正交表实施过程中出现的产量最高的组合A3B3C2D1（9号处理）做验证试验，将冬虫夏草菌块接种在此两种培养基上后，在完全黑暗、18℃的环境下，培养40 d，分别收集分生孢子，血细胞计数板计数分生孢子产量。最优组合A2B3C2D2的单菌落分生孢子产量为2.75×105个，9号处理在同条件下的产量为1.90×105个，最优组合比正交试验实施过程中9号处理的产量提高了44 %。

2.3最佳收获时间的确定

培养时间对冬虫夏草菌产孢量的影响见图1。

图1培养时间对冬虫夏草菌产孢量的影响Fig.1 The effect of different days on the conidia production of Ophiocordyceps sinensis

由图1可知，随培养时间不同，冬虫夏草菌单菌落分生孢子产量也不同。30 d到35 d，孢子产量增长最快，35 d到40 d，孢子产量增长缓慢，多数处理的孢子产量在40 d时达到最高；40 d开始，多数处理的培养基上孢子产量开始降低，个别处理孢子产量仍然有所增加，但增加的很少；43 d至45 d，孢子产量下降不是很明显，45 d后孢子产量急剧下降（图1）。因此将冬虫夏草菌分生孢子收获的最佳时间定为40 d。

2.4各培养条件对产孢量的影响

培养时间对冬虫夏草菌产孢量的影响见表5。

表5培养时间对冬虫夏草菌产孢量的影响Table 5 The effect of temperature，pH and light on the conidia production

由表5可知，14℃比18℃孢子产量高；冬虫夏草菌产孢对pH要求比较严格，在pH5.80时产孢量最高，pH偏离0.6个单位以上时，产孢量急剧下降；连续黑暗的培养条件有利于冬虫夏草菌产孢，12 h光照/12 h黑暗培养的产孢量比连续黑暗培养的产孢量显著低，且在培养的过程中发现，40 d时光照培养的菌落中央部位颜色为褐色，连续黑暗培养的菌落颜色整体为白色，推测光照可能会导致冬虫夏草菌的提前老化。

3　讨论与结论

分生孢子是部分真菌无性繁殖的主要方式之一，不仅可以保证真菌一定的繁殖速度和繁殖量，而且也是某些致病真菌和寄生真菌侵入宿主的主要方式之一[12]。分生孢子的形成与培养条件和培养基成分关系密切，关于最佳培养条件的确定，本研究主要探讨了最佳收获时间和最适培养温度。本研究确定的最佳收获时间为40 d，这一结果与文献[10]报道的30天时分生孢子产量最高不同，原因可能为所采用的中国被毛孢菌株不同和培养基成分不同有关。培养基成分方面，除了重要的碳源和氮源外，微量元素和生长因子对真菌产生分生孢子也有一定的影响[11，13-14]。

本研究通过单因素试验和正交试验对冬虫夏草产分生孢子培养基进行优化，同时探讨了培养条件（温度、光照和pH）对分生孢子产量的影响，确定出了冬虫夏草菌产分生孢子的最佳条件。最佳的冬虫夏草产分生孢子培养基组成为：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl1.0g，FeSO4·7H2O0.05g，ZnCl20.09g，组氨酸0.3g，赖氨酸0.3 g，纯牛奶200 mL，超纯水补充至1 000 mL。最佳培养条件为：14℃、pH5.80、完全黑暗的环境下，培养40 d。优化后分生孢子产量是优化前的3.6倍，为进一步筛选冬虫夏草产分生孢子培养基提供了一定的参考，也为今后冬虫夏草人工培育的规模化、现代化生产奠定了一定的研究基础。

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Research on the Artificial Cultivation of the Conidia by Ophiocordyceps Sinensis

LI Ling-ling，LUO He-chun，HU Min
（Biochemistry Engineering Department，Chongqing Industry&Trade Polytechnic，Chongqing 408000，China）

Abstract：Using the single factor and the orthogonal test，the optimal culture medium for the conidia of Ophiocordyceps sinensis were studied. The effect of temperature，pH and light on the conidia production were also studied. The best culture medium recipe was：glucose 30 g，yeast extract 10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，ZnCl20.09 g，histidine 0.3 g lysine 0.3 g，pure milk 200 mL，the ultrapure water added to 1 000 mL. The maximum conidia production was produced under the optimal conditions：temperature 14℃，pH 5.80 and complete darkness for 40 d. Under the conditions，the maximum conidia production was 2.98×105. After optimization，the conidia production was 3.6 times more than that of the basal culture medium. The conidia production was significantly increased after optimization，which might be beneficial to workload in scale up fermentation later.

Key words：Ophiocordyceps sinensis；conidia；medium optimization

收稿日期：2015-09-30

作者简介：李玲玲（1980—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：微生物制药。

基金项目：重庆市教委科学技术研究项目（KJ112302）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.047