不同提取条件对玫瑰花中总黄酮品质的影响

郭焰，豆一玲，白羽嘉，黄文书，冯作山，*（.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐8300；.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐83005）



不同提取条件对玫瑰花中总黄酮品质的影响

郭焰1，豆一玲1，白羽嘉2，黄文书2，冯作山2，*
（1.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐830021；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

摘要：利用单因素试验和正交试验的方法，研究在微波辅助下，以乙醇为萃取剂提取新疆南疆地区玫瑰花中总黄酮的工艺条件，并对提取的总黄酮进行定性分析与吸附纯化。结果表明，最佳提取工艺条件是乙醇浓度50 %、料液比1∶20（g/mL）、微波时间40s、微波功率900 W、提取2次。此条件下玫瑰花中总黄酮含量为3.73 %。通过颜色反应初步鉴定玫瑰花黄酮提取液，确定其中含有黄酮及黄酮醇类等成分。利用AB-8大孔树脂吸附纯化玫瑰花总黄酮，通过吸附、解吸实验，结果显示，吸附率37.58%，解析率48.50%，纯度25.4%。

关键词：玫瑰花；总黄酮；微波提取；定性分析；大孔树脂

玫瑰花，为蔷薇科蔷薇，属多年生常绿或落叶灌木，含有多种维生素、脂肪酸、氨基酸、微量元素、多种糖类和丰富的花青素、黄酮类物质、生物碱等活性成分[1]。以其具有的较高药用和营养价值，吸引了越来越多人们的关注。新疆南疆地区有大量的适应性强、产量高的玫瑰资源，这里的玫瑰花主要用于加工玫瑰酱、玫瑰花茶、玫瑰精油，产品品种少、附加值低，未能充分利用。

黄酮类物质是自然界药用植物中主要活性成分之一。众多研究表明：黄酮类物质具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老以及防止骨质疏松、保护心血管、降血脂等疗效[2]。传统的黄酮提取方法存在操作繁琐、提取率低、溶剂用量大等缺点，而微波辅助提取方法具有安全、快速、选择性好、穿透力强等优点，是近年来发展起来的一种新技术[3]。在天然产物的富集和分离纯化中广泛应用的大孔树脂以其物理化学稳定高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、易解吸、成本低等特点呈现良好的发展趋势[4]。

本试验将微波技术用于玫瑰花总黄酮的提取，采用正交设计法对微波辅助提取玫瑰花总黄酮的工艺条件进行优选，测定最佳提取条件下的玫瑰花总黄酮含量，采用颜色反应对提取液中的总黄酮类化合物进行初步定性分析，同时采用大孔树脂对提取液中的总黄酮进行富集、纯化，旨在促进新疆玫瑰花的精深加工和综合利用技术的发展。

1　材料与仪器

1.1材料

新鲜玫瑰花：新疆喀什玫源公司提供，干燥，粉碎，过20目筛。

1.2仪器

TU-1810PC型紫外-可见分光光度计：北京普析通用公司；WD900ASL23-2型微波炉：LG电子（天津）电器有限公司；HH－4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；101型电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；BS224S分析天平：北京赛多利斯仪器设备有限公司；LD4-2A型离心机：北京医用离心机厂；N-1001型旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂。

1.3试剂

芦丁标准品：生化试剂，购自Sigma公司；95 %乙醇、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝、浓硫酸、盐酸、镁粉、醋酸镁、氨水、三氯化铁、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇：均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；AB-8（D-101）大孔吸附树脂：天津市光复精细化工研究所。

2　方法

2.1总黄酮提取剂选择

用无水乙醇、50 %乙醇、水、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、甲醇各40 mL对玫瑰花浸提、过夜后过滤，提取液经水浴浓缩后进行干燥、溶解试验。结果发现，上述有机溶剂对玫瑰花中总黄酮均有一定的抽提效果，其中以50 %乙醇、甲醇的抽提效果最好，从提取液、干燥物、溶解时颜色一直很稳定，而其它提取剂有不同程度的颜色变化。乙醇对天然植物细胞有较强的穿透能力，且提取液透亮不易发霉变质，较之甲醇毒性小，因此，本试验采用50 %乙醇溶液作为提取剂。

2.2提取与纯化工艺流程

2.3总黄酮含量测定方法

玫瑰花中总黄酮含量测定采用硝酸铝分光光度法[5]。

2.3.1制作标准曲线

精确称取干燥至恒重的芦丁标准品0.003 1 g，用50%乙醇溶解，定容到100mL容量瓶中，制成31.0 μg/mL的芦丁标准溶液。分别移取该标准液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于25 mL容量瓶中，加5 %亚硝酸钠溶液1.00 mL，混匀，放置6 min，加10 %硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min，加10 %氢氧化钠试液10.00 mL，用50 %乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以芦丁空白为对照，用1 cm比色皿在510 nm波长处测定吸光度A。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为：y=0.102 5x-0.000 4，（R2=0.999 1）。

2.3.2样品测定

吸取1.00 mL提取液于25 mL容量瓶中，按照上述方法，测定提取液的吸光度。通过标准曲线的回归方程换算成浓度Y（mg/mL），则玫瑰花提取液中总黄酮含量C（%）：

C/% = 100×（Y×100×25）/（2×1 000）

2.4总黄酮提取工艺单因素试验

准确称取1.00 g玫瑰花粉末3份于3个100 mL烧杯中，分别在不同的乙醇浓度、料液比、提取时间、微波功率、提取次数等条件下进行试验。考察对总黄酮提取率的影响，以确定相关因素及其范围。

2.5正交试验优化总黄酮提取工艺

根据单因素试验结果，选择料液比、提取时间、乙醇浓度3个因素，进行L9（34）的正交试验，对玫瑰花中总黄酮提取条件进行优化。正交设计方案见表1。

表1正交试验因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment test

2.6玫瑰花总黄酮定性分析[6-7]

2.6.1盐酸—镁粉还原反应

取样品液1.00 mL于试管中，加入少许镁粉及浓盐酸，振摇，观察颜色变化。

2.6.2浓硫酸显色剂试验

取样品液1.00 mL于试管中，加入浓硫酸数滴，振摇，喷于滤纸上，吹干，观察颜色变化。

2.6.3氨水显色剂试验

用玻璃棒蘸取样品液点在滤纸上，吹干，将滤纸放在氨水上方熏0.5 min左右，观察颜色变化。

2.6.4三氯化铝络合反应

用玻璃棒蘸取样品液点在滤纸上，吹干，喷1 %三氯化铝乙醇溶液，吹干，于紫外光下观察颜色变化。

2.6.5醋酸镁络合反应

用玻璃棒蘸取样品液点在滤纸上，吹干，喷1 %醋酸镁甲醇溶液，吹干，于紫外光下观察颜色变化。

2.6.6三氯化铁酚羟基反应

取样品液1.00 mL于试管中，加入数滴1 %三氯化铁乙醇溶液，振摇，观察颜色变化。

2.7玫瑰花总黄酮的纯化

2.7.1大孔吸附树脂的预处理[8]

将AB-8树脂用95 %乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，用乙醇清洗至洗出液无白浊色为止，再以蒸馏水洗去乙醇至无醇味，然后酸碱处理，再用蒸馏水清洗至洗出液呈中性。

以乙醇湿法装柱，用95 %乙醇在柱上流动清洗，检查流出的乙醇与水混合不呈白浊色为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇，避免因为少量乙醇的存在而降低大孔吸附树脂的吸附力。

将玫瑰花黄酮提取液直接加到已经处理好的大孔吸附树脂柱顶。浓缩液经大孔吸附树脂柱分离，以50 %乙醇为洗脱溶剂进行洗脱，收集洗脱液并浓缩。2.7.2 AB-8树脂对总黄酮的静态吸附量与解吸率测定[9]

准确称取5.000 0 g预处理好的湿树脂于100 mL具塞三角瓶中，加入一定浓度（C0）的玫瑰花黄酮提取液10 mL，在30℃下振荡24 h，过滤，得滤液1，测其黄酮浓度（C1）。按下式计算吸附量和吸附率。

吸附率A/% =（C0- C1）/C0×100

吸附量Q/（mg/g）=（C0- C1）×V/W

式中：C0为粗提液原液浓度，mg/mL；C1为吸附后剩余溶液浓度，mg/mL；C2为洗脱液浓度，mg/mL；V为吸附溶液体积，mL；W为树脂重量，g。

将充分吸附后的树脂用蒸馏水清洗至树脂表面无提取溶液残留，滤纸吸干树脂表面残留的溶液，然后置于100 mL具塞三角瓶中，加入无水乙醇50 mL，在30℃下振荡解析24 h，过滤，得滤液2，测其黄酮浓度（C2）。按下式计算解吸率。

解吸率D/% =（V×C2）/（W×Q）×100

式中：V为解吸液体积，mL；C2为解吸后溶液中总黄酮浓度，mg/mL。

2.7.3 AB-8树脂对总黄酮的动态吸附量与解吸率测定[9]

常规湿法装柱，将一定体积、一定浓度的粗提液注入树脂柱中，待样品溶液全部通过树脂柱后用去离子水洗至流出液基本无色时，加入一定体积的洗脱剂，收集洗脱液，检测其浓度，然后将洗脱液经旋转蒸发浓缩。真空干燥，称量质量，计算后可得黄酮纯度与得率。

纯度/% =（X×V/G）×100

得率/% = X×V/（X样×V样）×100

式中：X为洗脱液中黄酮浓度，mg/mL；V为洗脱液体积，mL；X样为上样样品中黄酮浓度，mg/mL；V样为上样体积，mL；G为洗脱液浓缩烘干后的固形物重量，mg。

3　结果与分析

3.1总黄酮提取条件的确定

3.1.1不同提取次数对提取效果的影响提取次数对提取效果的影响见图1。

图1提取次数对提取效果的影响Fig.1 The effect of extraction times on extraction efficiency

由图1可知，提取3次的吸光度值为0.950，提取2次的吸光度值已达到0.930。表明提取2次已将玫瑰花中绝大多数的黄酮类化合物提取出来，因此可确定最佳提取次数为2次。

3.1.2不同乙醇浓度对提取效果的影响

提取剂浓度对提取效果的影响见图2。

图2提取剂浓度对提取效果的影响Fig.2 The effect of concentration on extraction efficiency

由图2可见，黄酮提取效果随乙醇浓度的增大有下降的趋势，50 %的乙醇浓度为较好的提取条件，提取液的吸光度值为0.860，乙醇浓度对黄酮提取效果影响较大。

3.1.3不同微波时间对提取效果的影响

提取时间对提取效果的影响见图3。

图3提取时间对提取效果的影响Fig.3 The effect of time on extraction efficiency

结果表明，黄酮提取效果随着微波时间的延长呈上升趋势，但延长到一定程度时反而下降了。40 s时细胞中的有效成分已完全溶出，再延长时间，非但不能获得较好的提取效果，反而会导致黄酮因受热降解，因此选择提取时间为40 s为适宜条件。

3.1.4不同微波功率对提取效果的影响

微波功率对提取效果的影响见图4。

图4微波功率对提取效果的影响Fig.4 The effect of microwave power on extraction efficiency

由图4看出，黄酮提取效果随微波功率的增大而增加，微波功率为900 W时提取效果最好，由于试验设备的局限，未能试验更高微波功率对黄酮提取效果的影响。

3.1.5不同料液比对提取效果的影响

料液比对提取效果的影响见图5。

由图5可知，提取效果随料液比的增大呈上升趋势，但增加到一定程度就趋于平稳，增加料液比意味着溶剂用量的增加和后续溶剂回收能耗增大。一般来说，只要能将活性物质溶出，料液比越小越好，料液比为1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的提取液吸光度值变化很小，说明料液比达到1∶20（g/mL）能将玫瑰花中黄酮提取比较完全，从经济角度考虑，选取料液比为1∶20（g/mL）适宜。

图5料液比对提取效果的影响Fig.5 The effect of liquid to solid ratio on extraction efficiency

3.2正交试验设计结果

在上述单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验对玫瑰花中总黄酮提取条件进行优化，确定最佳的提取工艺条件。结果见表2。

表2正交结果分析表Table 2 The result of orthogonal test

由表2可知，影响玫瑰花中总黄酮提取效果的主次顺序依次是料液比＞乙醇浓度＞微波处理时间；同时综合上述单因素试验结果，得到玫瑰花中总黄酮提取的最优工艺条件为A2B2C2，即料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度50 %，微波处理时间40 s。取3份玫瑰花样品以最优试验条件做验证试验，测得吸光度平均值为0.874 5，与正交分析结果相符。

3.3总黄酮含量测定结果

在正交试验优化微波辅助提取玫瑰花中总黄酮的最优技术条件下，得出玫瑰花中总黄酮含量为3.73%。3.4提取液定性分析结果

对玫瑰花黄酮提取液进行定性分析，与芦丁溶液的显色结果进行比较，见表3。

表3颜色反应鉴定结果Table 3 Results of identification of the reaction of color

由黄酮定性显色反应可以判断玫瑰花黄酮提取液中可能含有黄酮，黄酮醇，二氢黄酮等黄酮类化合物。3.5玫瑰花总黄酮纯化结果

用AB-8大孔吸附树脂对玫瑰花渣中黄酮类化合物进行纯化，吸附率37.58 %，解析率48.50 %，纯度25.4 %。结果见表4、表5。

表4静态吸附与解吸结果Table 4 Result on static adsorption and desorptio

表5动态吸附与解吸结果Table 5 Dynamic adsorption and desorptio　%

4　结论

1）影响玫瑰花总黄酮提取效果的主次顺序依次是料液比＞乙醇浓度＞微波时间，新疆玫瑰花总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度50 %，微波辐射时间40 s，料液比1∶20（g/mL），微波功率900 W，提取次数2次，此条件下玫瑰花中总黄酮含量为3.73 %。

2）通过颜色反应鉴定玫瑰花黄酮提取液，结果显示玫瑰花总黄酮类化合物包括黄酮及黄酮醇类等成分。

3）利用AB-8大孔树脂吸附纯化玫瑰花总黄酮，吸附率37.58 %，解析率48.50 %，纯度25.4 %。

参考文献：

[1]郭焰,黄文书,赵靖靖,等.玫瑰花青素的微波法辅助提取工艺研究[J].中国食物与营养,2009,123(12):42-44

[2]黄文书,常雪花,曹利花,等.响应面法优化微波辅助提取玫瑰花总黄酮工艺[J].食品研究与开发,2011,32(5):37-40

[3]马梅芳,高宇.微波萃取在中药成分提取中的应用研究进展[J].江西中医学院学报,2005 ,17(5):74-77

[4]唐丽丽,刘邻渭,孙丽芳,等.大孔树脂对石榴皮中多酚物质的吸附研究[ J] .食品研究与开发,2011,32(5):48-51

[5]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M]. 2005版.北京:化学工业出版社,2005:16

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[7]张益娜,谢琼,李敏,等．新疆沙棘叶总黄酮的微波辅助提取和鉴别[J]．新疆农业科学,2007,44(6):761-764

[8]杨红.中药化学实用技术[M].北京:化学工业出版社,2004:956-960

[9]徐家毅,郭贤权.大孔树脂孔结构的测定[J].高分子通报,1999,2 (6):52-60

Influence of Different Extracting Methods on Flavonoids in Roses

GUO Yan1，DOU Yi-ling1，BAI Yu-jia2，HUANG Wen-shu2，FENG Zuo-shan2，*
（1. Xinjiang Institute of Light Industry Vocational and Technical，Urumqi 830021，Xinjiang，China；2. College of Food Scicnce and Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China）

Abstract：Using single factor and orthogonal test method，studied on microwave-assisted extracting total flavonoids from rose in Southern Xinjiang，and the extraction of flavonoids were qualitatively analyzed and adsorption purification. The results showed that the optimum extracting technology were as follows：alcohol contraction 50 %，solid-liquid ratio 1∶20（g/mL），microwave extraction time 40 s，microwave power 900 W，extraction 2 times. On these conditions，the total content of flavonoids in the roses was 3.73 %. Flavone and flavonol were identified by initial color authentication in flavonoids.The AB-8 macroporous resin was used to purify total flavonoids of rose，adsorption and desorption experiment results showed that：adsorption rate 37.58 %，desorption rate 48.50 %，purity 25.4 %.

Key words：rose；flavonoids；microwave-assisted extraction；qualitative analysis；macroporous resin

收稿日期：2015-06-13

*通信作者：冯作山，教授，博士，研究方向：农产品贮藏与加工研究。

作者简介：郭焰（1967—），女（回），高级实验师，硕士，研究方向：食品加工原理及技术。

基金项目：教育部“春晖计划”合作科研项目（Z2006-1-83001）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.025