苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌的抑制作用研究

崔国庭，王缎，2，郭金英，徐宝成，向进乐（.河南科技大学，河南洛阳47023；2.永成职业学院，河南永城476600）



苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌的抑制作用研究

崔国庭1，王缎1，2，郭金英1，徐宝成1，向进乐1
（1.河南科技大学，河南洛阳471023；2.永成职业学院，河南永城476600）

摘要：以猕猴桃溃疡菌为研究对象，考察了苍耳叶提取物对该菌的抑制作用及抑菌机理。试验结果表明，苍耳叶的乙醇提取物对猕猴桃溃疡菌的抑菌活性最强，其最低抑菌浓度（MIC）为50 μg/mL；浓度高于100 μg/mL时，对溃疡菌细胞壁的完整性造成破坏，引起猕猴桃溃疡菌菌内分子如糖、蛋白质、核酸外泄，从而达到抑菌、杀菌的作用。

关键词：苍耳；猕猴桃溃疡菌；抑制作用

猕猴桃溃菌（Pseudomonas syringae pv·Actinidiae），是引起猕猴桃溃疡病的主要病原菌。猕猴桃溃疡病（Kiwifruit bacterial canker）是猕猴桃栽培过程中最具毁灭性的病害之一。该病于1980年在日本首次报道，随后在美国、韩国[1]、新西兰、法国[2]、西班牙[3]、意大利[4]、伊朗[5]等地陆续有该病的相关报道。猕猴桃溃疡菌引发的溃疡病成为猕猴桃的主要病害之一，病害发生时，猕猴桃树整株枯死，造成果园毁灭，颗粒无收，产量与品质严重受损[6-7]。含铜杀菌剂、链霉素等最初作为抑制猕猴桃溃疡菌有效的药物，随着抗铜离子、抗链霉素菌株的出现，这些杀菌剂抗菌效果不断的减弱[8]。寻找到新的有效抑制猕猴桃溃疡菌的杀菌剂成为目前猕猴桃产业的迫切需求。

苍耳（Xanthium sibiricum Patr ex Widder）属菊科、苍耳属，亦称呆耳、老场子、常思、卷耳、爵耳、猪耳、耳、地葵、羊负来、芨芨。分布全国各地，全草有毒，尤其以幼苗、嫩芽、种子的毒性最大，苷类、毒蛋白、氢醌为毒性主要成分，倍半萜内酯和水溶性苷类是主要的两类活性成分。苍耳提取物具有杀虫、抑菌、抑制植物生长的功能[9-10]，肖家军研究发现苍耳叶挥发油具有抑菌及抗氧化功能[11]。目前，有关苍耳叶提取物对于猕猴溃疡菌的抑制作用与机理的研究鲜见报道，本文就这方面的进行了初步的研究。

1.1材料与试剂

供试菌种为猕猴桃溃菌（Pseudomonas syringae pv·Actinidiae）：西北农林科技大学理学院提供。

苍耳叶：来自西北农林科技大学。

无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚：分析纯，上海沪试实验室器材股份有限公司。

1.2主要仪器

RE-3000B旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FD-1A冷冻干燥机：北京亚泰科隆实验科技开发中心；DGX-9053B-1恒温干燥箱、DPX-9052B-2恒温培养箱：上海福玛实验设备有限公司；YQ-020A超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司；TQZ-312恒温摇床：上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：上海尚道仪器制造有限公司；BCD-216SDN海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司。

1.3试验方法

1.3.1苍耳叶提取物的制备

苍耳叶经50℃干燥后粉碎，过60目筛，取苍耳叶粉100 g，用70 %乙醇以料液比为1∶10（g/mL）在50℃条件下水浴浸提8 h，浸提2次，合并提取液、用旋转蒸发器减压浓缩至膏状、真空冻干机中干燥、粉碎即得苍耳叶乙醇粗提取物，取4mg溶于1mL70%乙醇中，4℃贮存备用。

1.3.2培养基及猕猴桃溃疡菌悬液的制备

培养基的制备：KB培养基。1 L水中加入20 g蛋白胨、1.5 g硫酸镁、1.5 g磷酸氢二钾、17 g琼脂，加热溶解，121℃高压灭菌30 min，趁热在超净工作台上倒入无菌平皿，备用。

菌悬液的制备：挑选长势较好的猕猴桃溃疡菌接入不含琼脂的KB液体培养基中，恒温摇床培养16 h～24 h，使菌活化繁殖，当菌液由透明变黄色混浊时停止培养，置冰箱中备用。

1.3.3苍耳叶提取物中不同极性部分的抑菌活性

抑菌滤纸片的制备：将定量的普通滤纸用打孔器打成直径为6 mm圆片，置于洁净干燥试管内120℃干热灭菌2h后，分别浸于6种不同浓度的药液中24h，晾干备用。

抑菌实验（琼脂平板扩散法）：取倒入培养基的平皿，均匀涂布一层稀释的试验菌，试验菌用量以对照平皿表面菌生长能呈半密集菌落为定。将均匀涂菌后的琼脂平板置于30℃恒温培养箱中5 min，使表面干燥，用无菌镊子将抑菌滤纸片按标号依次均匀贴在培养基表面，轻压纸片使接触良好。30℃倒置培养12 h，取出平板，观察抑菌圈大小并测定其直径。

取一定量的苍耳叶提取物，分别用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、水配制成浓度为10 mg/mL的悬浊液，3 500 r/min离心15 min，取上清液测定抑菌活性，对比不同极性溶剂抑菌活性的大小。

1.3.4最低抑菌浓度（MIC）[12]

最低抑菌浓度是指在体外能够抑制细菌生长的最低浓度。取一定量的苍耳叶提取物，配制成浓度为（4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.1、0.05、0.025 mg/mL）的溶液。取10 μL不同浓度的样液，点于无菌滤纸片上，待溶剂挥发干，将载有药的滤纸片放入表面涂过菌液的培养基，压紧。放入28℃恒温培养箱，培养24 h，观察不同浓度样液的抑菌圈直径大小，确定最低抑菌浓度，重复3次。

1.3.5苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌致死曲线的测定[13-14]

活化猕猴桃溃疡菌，将其接种于肉汤培养基中，28℃培养12 h，加入苍耳叶提取物28℃条件下，过一段时间取培养液进行平板活菌计数，与未加苍耳叶提取物的菌液对比，观察苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌的致死曲线。

1.3.6苍耳叶提取物的热稳定性[15]

苍耳叶提取物置于不同加热条件（50、60、70、80、90、100℃）下处理分别30、25、20、15、10、5 min，以各供试菌的2倍MIC的量，在灭菌培养基中加入苍耳叶提取物，分别测定抑菌圈直径，重复3次。

1.3.7猕猴桃溃疡菌培养液中蛋白质浓度的测定[16-17]

活化猕猴桃溃疡菌，28℃、200r/min振荡培养12h，加入苍耳叶提取物，使其最终浓度达到150 μg/mL，分别于0、1、2、3、4、5、6 h采用Bradford法[18]测定菌液中蛋白质含量，用蒸馏水代替苍耳叶提取物作为对照组，试验重复3次。

1.3.8猕猴桃溃疡菌培养液中可溶性总糖的测定[19]

活化猕猴桃溃疡菌，28℃、100 r/min振荡培养12 h，取适量菌液，加入苍耳叶提取物，使其最终浓度达到100 μg/mL，分别于28℃、100 r/min培养0、1、2、4、6、8 h后取出，4 000 r/min离心20 min，取上清液200 μL，加水稀释至1.0 mL，加入蒽酮试剂4.0 mL，冷却5 min，沸水浴10 min，室温冷却10 min，在620 nm处测定吸光值，以葡萄糖标准溶液作标准曲线，以无菌水代替苍耳叶提取物作为空白对照，试验重复3次。1.3.9猕猴桃溃疡菌培养液中核酸含量的测定[20]

取活化后的猕猴桃溃疡菌转接到金氏KB肉汤培养基中，28℃培养12 h、离心（4 000 r/min，10 min），弃上清，用pH7.4磷酸缓冲液（0.1 mol/L）稀释菌体，获得大约106CFU/mL的菌液；加入苍耳叶提取物，在260 nm测定吸光度，以pH7.4磷酸缓冲液调零，以pH7.4磷酸缓冲液替代苍耳叶作为对照。试验重复3次。

2　结果与分析

2.1不同萃取相提取物对猕猴桃溃疡菌的抑制作用苍耳叶物经不同极性溶剂萃取后获得相应的萃

取相。在供试浓度为10 mg/mL时，不同萃取相对猕猴桃溃疡菌的抑制效果见表1。

表1不同萃取相的抑菌圈直径Table 1 Bacteriostatical diameter of different concentration extract phase extract to germ

由表1可看出，各萃取相对供试病原菌都具有抑制作用，其抑制作用由大到小依次为：乙醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相。乙醇对细菌的抑制效果优于其他萃取相，说明苍耳叶中的抑菌物质主要集中在高极性部位，对此部分提取物的进一步追踪分离将有望发现具开发价值的抗菌活性物质。

2.2最低抑菌浓度（MIC）

苍耳叶乙醇提取物抑菌作用与浓度的关系，结果见表2。

表2最小抑菌浓度Table 2 The results of the lowest concentration of suppression medicaments

由表2可以看出，随着提取物浓度的降低，抑菌效果随之下降，当提取物浓度低于0.05 mg/mL时，抑菌圈直径为0，该提取物的最低抑菌浓度为0.05 mg/mL。2.3猕猴桃溃疡菌的死亡曲线

苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌的致死作用见图1。

图1致死曲线Fig.1 The death curve of the bacteria

从图1可以看出，苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌的杀死作用与其浓度有关。当苍耳叶提取物浓度高于100 μg/mL时，在4 h内能够杀死猕猴桃溃疡菌；当加入的浓度为25 μg/mL时，虽然可以再一定时间内抑制猕猴桃溃疡菌的生长，但不能灭菌，而且随着时间的延长，细菌呈上升趋势。

2.4苍耳叶提取物物热稳定性

苍耳叶提取物热稳定性，见表3。

表3苍耳叶提取物的热稳定性Table 3 The thermostability on extractive of Xanthium sibiricum Patr.leaf

由表3可以看到，不同热处理条件对苍耳叶提取物的抑菌作用有不同程度的影响。在温度低于50℃，30 min以内的热处理对提取物抑菌作用没有影响。随着热处理的温度的升高，苍耳叶提取物的抑菌作用减弱，但减弱的程度还与热处理的时间相关，高温短时间处理抑菌作用强于较低温度长时间处理。

2.5苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌菌液中蛋白质浓度的影响

苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌菌液中蛋白质浓度的影响结果见图2。

图2苍耳叶提取物对菌液中蛋白质浓度的影响Fig.2 The effect of the extraction from Xanthium sibiricum Patr. leaf on protein content of bacteria

细菌细胞膜是细菌的保护屏障，具有流动性和半透性等功能，但当细菌细胞膜遭到破坏后，细胞膜所固有的功能将会丧失，导致细菌细胞膜的流动性降低和通透性增大，从而对菌体的保护作用被打破，细胞内部物质蛋白质外泄至液体培养基中，导致培养液中蛋白质含量上升，因此，细菌细胞膜通透性的变化可由菌液中蛋白质含量的变化情况来反映[21]。由图2可以看到，苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌细胞膜渗漏具有显著的影响，并随着作用时间的增加而愈加明显。实验结果显示，添加苍耳叶提取物后6 h的猕猴桃溃疡菌培养液中蛋白浓度为未加苍耳叶提取物处理的对照培养液中蛋白浓度的5.9倍。由此可见，添加苍耳叶提取物的培养菌液其蛋白浓度远高于对照组，这主要是由于苍耳叶提取物可改变细菌细胞的膜透性，致使细胞内的蛋白质渗漏到体外的培养液中。

2.6菌液中的可溶性总糖

糖类是微生物首要的碳源和能源储备物质。当细菌处于正常生理状态时，会吸收利用外源的营养成分，而当膜结构遭到破坏时，细胞内容物包括糖类发生外泄，通过测定细菌培养液中糖浓度的变化，可以了解细菌膜结构的完整性[22-23]。苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌菌液中可溶性总糖含量的影响见图3。

图3苍耳叶提取物对菌液中糖含量的影响Fig.3 The effect of the extraction from Xanthium sibiricum Patr. leaf on sugar content of bacteria

如图3所示，当猕猴桃溃疡菌与100 μg/mL的苍耳叶提取物作用后，培养液中总糖的浓度随着作用时间的延长逐渐上升，表明它们的细胞膜结构遭到破坏，胞内的糖类物质逐渐渗漏到胞外；然而，对照组均显示了培养液中总糖浓度的没有太多变化。这个试验结果与上个试验结果相接近，说明苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌菌膜有破坏作用。

2.7菌液中的核酸

核酸是细菌的遗传物质，在细菌菌膜完整的情况下，只存在于细菌内。细菌的菌膜破裂，细菌死亡，核酸就可以泄露出来，通过测定菌液260 nm处的吸光度，就能够了解DNA、RNA在菌液中的变化[24]。苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌菌液中核酸含量的影响结果见图4。

图4苍耳叶提取物对菌液中核酸含量的影响Fig.4 The effect of the extraction from Xanthium sibiricum Patr. leaf on nucleinic acid content of bacteria

由图4可以看到，加入苍耳叶提取物250 μg/mL之后，菌液中核酸含量迅速升高并且达到平衡，表明在此浓度下，猕猴桃溃疡菌菌膜在短时间内遭到破坏，其DNA、RNA等大分子物质迅速释放出来，造成猕猴桃溃疡菌死亡，从而达到抑菌、灭菌的作用。

抗菌药物对于细菌的抑制、杀死的主要靶标有3个方面：一是对于细胞膜的破坏，干扰细胞膜的合成；二是对于蛋白质合成的干扰；三是对于遗传物质的复制和修复的干扰破坏[25]。从本次的试验研究表明，苍耳叶提取物能够抑制、杀死猕猴桃溃疡菌，其抑菌、杀菌的效果与苍耳叶提取物的剂量有直接的关系。

3　结论

研究结果表明，苍耳叶提取物对猕猴桃溃疡菌具有抑制、致死作用，且随着浓度的增加，抑菌、杀菌效果也增加。这预示苍耳叶不仅在食品保藏方面有应用价值，而且在猕猴桃溃疡病的防治方面也具有开发利用价值。苍耳叶提取物的抑菌、杀菌效果还与所用的提取溶剂有关，对于猕猴桃溃疡菌的抑制作用以乙醇为提取剂的抑菌效果最好，MIC为0.05 mg/mL，该抑菌物质对热具有一定的稳定性。乙醇对细菌的抑制效果优于其他萃取相，说明苍耳叶中的抑菌物质主要集中在高极性部位，对此部分提取物的进一步追踪分离将有望发现具开发价值的抗菌活性物质。研究结果还表明，苍耳叶提取物浓度高于100 μg/mL，对猕猴桃溃疡菌的细胞壁完整性造成破坏，引起溃疡菌内部物质如糖类、蛋白质、核酸等物质外泄，造成细菌死亡，从而达到抑菌、杀菌目的。提取物的具体作用靶点及作用机制，需要进一步研究和探讨。

在长期使用化学农药产生一系列公害问题的情况下，寻找“绿色农药”成为了时下非常紧迫的任务。植物源农药具有取之自然，用之自然，具有低毒、低残留、对非靶标生物及环境安全，不易产生抗药性，可降低或避免化学农药带来的“农药公害”等优点。植物源杀菌剂的研究这正符合现代人们对农药的要求及其未来农药的发展方向。苍耳叶为开发天然植物源杀菌剂增加了新的选择。

参考文献：

[1] Koh Y J, Kim G H, Jung J S,et al. Outbreak of bacterial canker on Hort16A (Actinidia chinensis Planchon) caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea[J].New Zealand journal of crop and horticultural science,2010,38(4):275-282

[2] Vanneste JL,Poliakoff F,Audusseau C,et al.First Report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae, the Causal Agent of Bacterial Canker of Kiwifruit in France[J].Plant disease, 2011,95(10):1311-1312

[3] Gonzalez A J,Avila M. Disease of Floral Buds of Kiwifruit in Spain Caused by Pseudomonas syringae[J]. Plant disease, 2001, 85(12): 1094

[4] Marcelletti S, Scortichini M. Clonal outbreaks of bacterial canker caused by pseudomonas syringae pv. actinidiae on actinidia chinensis and A.deliciosa in Italy[J]. Journal of plant pathology, 2011, 93 (2):479-483

[5] Mazarei M,Mostofipour P. First report of bacterial canker of kiwifruit in Iran[J]. Plant pathology,1994,43(6):1055-1056

[6]承河元,李瑶,万嗣坤,等.安徽省猕猴桃溃疡病病菌鉴定[J].安徽农业大学学报,1995,22(3):219-223

[7]刘绍基,唐显富,王忠肃,等.四川省苍溪猕猴桃溃疡病的发生规律[J].中国果树,1996(1):25-26

[8] Nakajima Masami, Goto Masao, Akutsu Katsumi,et al. Nucleotide sequence and organization of copper resistance genes from Pseudomonassyringaepv.Actinidiae[J].EuropeanJournalofPlantPathology, 2004,110(2) : 223-226

[9]王蓓,赵卫星.苍耳化学成分研究及应用[J].化工时刊, 2011, 25 (7):48-49

[10]欧丽红,秦路平.苍耳属药用植物资源及其化学成分和生物活性[J].药学实践杂志,2000,18(5):346-349

[11]肖家军,王云,戴仕奎,等.苍耳叶挥发油的提取及抑菌和抗氧化性研究[J].食品工业科技,2011,32(7):115-118

[12] A Martins, A Vasas, M Viveiros, et al. Antibacterial properties of compounds isolated from Carpobrotus edulis[J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2011,37(5): 438-444

[13] Gavin Rukholm, Clement Mugabe, Ali O Azghani, et al. Antibacterial activity of liposomal gentamicin against Pseudomonas aeruginosa: a time–kill study[J]. Journal of Antimicrobial Agents 2006,27(3) : 247-252

[14]周莉君,宋良成,侯若,等.马桑提取物的抑菌作用和抑菌机理的初步研究[J].四川大学学报, 2006,43(5):1165-1169

[15]周建新,嵇美华,汪海峰,等.花生壳乙醇提取物(EEPH)抗菌性的研究[J].中国粮油学报,2004,19(1):64-66

[16]孙京新,王文娟.茶多酚对假单胞菌抑菌机理研究[J]. 2010(1):36-39

[17]孙峋,汪靖超,李洪涛,等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报(自然科学版),2005,18(4):41-45

[18] Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal. Biochem,1976(72):248-254

[19]钱丽红,陶妍,谢晶.茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理[J].微生物学通报,2010,37(11): 1628-1633

[20] Ke Xing, Xi Guang Chen, Ming Kong, et al. Effect of oleoyl-chitosan nanoparticles as a novel antibacterial dispersion system on viability, membrane permeability and cell morphology of Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J]. Carbohydrate polymers, 2009, 76(1):17 -22

[21]谢晶,侯伟峰,汤毅,等.植酸对腐败希瓦氏菌的抑菌机理[J].食品工业科技,2011,32(10):85-88

[22]曾亮,黄建安,李赤翎,等.儿茶素的抑菌效果及机理研究[J].食品工业科技, 2009, 30(5): 89-92

[23] MT马迪根, JM马丁克,李明春,等.微生物生物学[M].北京:科学出版社, 2009: 95-113

[24] Chris Zhisheng Chen, Stuart L Cooper. Interactions between dendrimer biocides and bacterial membranes[J]. Biomaterials, 2002,23 (16):3359-3368

[25] Christopher Walsh. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance[J]. Nature, 2000,406(17):775-781

Study on Inhibition of Extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf to Pseudomonas syringae pv·Actinidiae

CUI Guo-ting1，WANG Duan1，2，GUO Jin-ying1，XU Bao-cheng1，XIANG Jin-le1
（1. Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China；2. Yongcheng Vocational College，Yongcheng 476600，Henan，China）

Abstract：Action mechanism and antimicrobial effect of extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf against the Pseudomonas syringae pv·Actinidiae were studied. The results showed that ethanol extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf showed the strongest antibacterial activity，the minimum inhibitory concentration of it against the Pseudomonas syringae pv·Actinidiae was 50 μg/mL，the completeness of cytoderm was destroyed and the permeability of bacterial cell membrane was increased in the presence of extraction of Xanthium sibiricum Patr. leaf when its concentration exceed 100 μg/mL，which caused transudation of sugar，protein and nucleic acid，that was the antimicrobial mechanism of extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf.

Key words：Xanthium sibiricum；Pseudomonas syringae pv·Actinidiae；inhibition

收稿日期：2014-10-12

作者简介：崔国庭（1978—），男（汉），讲师，博士研究生，研究方向：植物功能性成分提取与活性研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.008