VEGF-C在胃癌中的表达与微血管密度和淋巴结转移的关系及临床意义

周凤鸣　彭庆弟

635000 四川省达州市中心医院



VEGF-C在胃癌中的表达与微血管密度和淋巴结转移的关系及临床意义

周凤鸣彭庆弟

635000 四川省达州市中心医院

【摘要】目的探讨VEGF-C在胃癌中的表达与微血管密度和淋巴结转移及胃癌发生发展及预后的关系。方法纳入行胃癌手术切除患者的病例样本共计96例，对这96例胃癌样本采用qPCR检测血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的相对表达量及检测微血管密度(MVD)参数，并与淋巴结转移等预后情况进行相关性分析。结果VEGF-C相对表达量与患者的一般资料如年龄、性别、以及肿瘤的特征如大小、发病的部位、侵袭深度，肿瘤的分期及分化程度、是否远处转移等并不存在相关性(P>0.05)。而淋巴受累方面，淋巴受累组的VEGF-C相对表达量明显上调(P<0.05)，而无淋巴受累组的相对表达量与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)，VEGF-C相对表达量明显上调与淋巴结受累转移的风险有关。VEGF-C表达水平与MVD差异表达具有相关性。结论VEGF-C相对表达量水平与胃癌的淋巴结转移及预后有一定的相关性，但还需进一步系统研究。

【关键词】胃癌；预后；VEGF-C；微血管密度；淋巴结转移；相关性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:533～536)

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，我国的胃癌发病率一直居高不下，在世界范围内我国胃癌发病率约占47%，且多数患者患病后初次就诊已经伴有广泛的淋巴结转移或者远端的转移，失去了根治手术的机会，耽误了治疗的最佳时机。早期诊断对疾病的及时发现及治疗具有重要的临床意义[1-2]。近年来研究发现，在乳腺癌、肝癌、胆管癌、胃癌等多种肿瘤中VEGF-C在调控肿瘤血管的生成中具有重要的作用，在胃癌的发病中存在VEGF-C的上调，其作为促癌基因发挥肿瘤生长调控作用[3]。本研究收集胃癌患者VEGF-C的表达情况、淋巴结转移及MVD参数资料，通过分析VEGF与微血管新生及模式的演变规律，进一步探讨胃癌的抗血管生成及淋巴结转移之间的关系。

1材料与方法

1.1病例的收集

纳入我院普外科2012年1月至2015年1月行胃癌手术切除的96例患者病例样本，通过病理诊断均确诊为原发性胃癌，纳入研究的所有患者均为初诊的患者，且在术前未进行任何放疗、化疗及分子靶向治疗等。96例中男性74例，女性22例，年龄42～78岁，平均年龄为(61.34±1.13)岁。在术中取材之后，肿瘤的位置以病理组织报告为标准，将样本立即放置入液氮罐中保存，转入-80 ℃冰箱长期保存，在实验前取出，提取胃癌组织的RNA，同时进行病理学的监测，对胃癌组织的病理学进行分型，肿瘤的浸润程度按照国际抗癌联盟标准分类[4]，淋巴分化以及转移采用的国际WHO的诊断标准[5]进行分析判断，对所有手术治疗的患者从出院到死亡进行随访观察，随访的时间以每月1次。同时纳入健康人群23例作为对照组，所有受试者签订知情同意书，收集标本前该临床试验研究通过了医院伦理委员会的批准。

1.2实验试剂和仪器

试剂：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美国Invitroge公司)，TaqMix(东盛生物公司)，PCR试剂盒、TaqMan RNA试剂盒(美国Santa Cruz公司)，RNA提取试剂盒采用(美国Sigma)，DEPC(上海碧云天生物)，乙醇、异丙醇、氯仿(上海硕盟生物)。

仪器：高速冷冻离心机(德国BiofugeStratos)，-80 ℃~4 ℃冰箱(日本松下)，PCR仪(澳大利亚Rotor-gene)，紫外分光光度仪(Beckman Coulter 公司)。

1.3RNA提取及qPCR检测

对96例胃癌组织采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，采用TaqMan RNA试剂盒检测VEGF-C的相对表达量。采用RNU6作为内参进行校正。对VEGF-C的表达水平采用二步法进行检测，第一步是通过茎环引物来合成互补DNA，再通过RNA的逆转录系统对10 ng RNA进行逆转了反应体系进行反应，在PCR管加入10 μl的逆转录缓冲液，总的RNA浓度调整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆转录引物，在冰上混匀之后反应5 min，行梯度变形反应，反应条件为94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min，一次递减；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反应体系，该体体系具体形式：Taqman RNA的特异性引物与2×的 PCR Taqman Universal混合液相互混合之后通过逆转录PCR反应，再加入5μlcDNA到RNA的去酶的水当中，将体积扩增至20 μl，通过循环反应94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min递减的扩张40个循环之后，对实验结果进行分析，采用荧光实时定量反应，按照PCR操作说明，Ct的检测值应当在20～32之外的需要进行第2次检测。应用△Ct=CtVEGF-C-CtRNU6的计算公式计算VEGF-C的相对表达量。

MVD的检测：资深病理专家对切片复核确认，利用相应的存档组织蜡块进行VEGF-C免疫组化染色，标记微血管密度，记录观察微血管的生长模式。

1.4统计学检测

所有纳入分析研究的数据采用SPSS 21.0的统计软件建立数据库，将VEGF-C表达水平分为2组，小于平均值为低表达组，大于平均值作为高表达组。通过分析VEGF-C的表达水平高低与发病相关因素分析以逐步回归法筛选有统计学意义的变量，对临床病理因素之间的风险情况采用Logistic回归分析，组间比较用方差分析，组间均数比较采用t检验，组间率的比较用卡方检验，两两比较采用LSD检验。应用Kruskal-wallis H检验进行多组间数据的比较，具有统计学差异的以P<0.05表示。

2结果

2.1VEGF-C的相对表达量与临床病理特征之间的相关性

96例胃癌组织的VEGF-C的相对表达量为1.436，95%CI为0.323～0.534，表达量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例。VEGF-C相对表达量与患者的一般资料如年龄、性别、以及肿瘤的特征如大小、发病的部位、侵袭深度，肿瘤的分期及分化程度、是否远处转移等并不存在相关性(P>0.05)。而淋巴受累方面，淋巴受累组的VEGF-C相对表达量明显上调(P<0.05)，而无淋巴受累组的相对表达量与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)，VEGF-C相对表达量明显上调与淋巴结受累转移的风险有关，见表1。

2.2VEGF-C相对表达量的高低与淋巴结转移风险之间的关系

采用logistic回归分析VEGF-C相对表达量的高低与淋巴结转移风险之间的相关性，VEGF-C相对表达量的上升会增加胃癌淋巴结转移的风险性，OR(95%CI)=3.15(2.13～9.27)，通过调整风险其OR=5.16，95%CI为1.27～20.83，P=0.03。

2.3胃癌组织中VEGF-C的表达水平与MVD的相关性

VEGF的蛋白表达水平与MVD差异表达具有相关性(高表达：γ=0.86，P=0.01，低表达：γ=0.75，P=0.02)，见表2。

表1　VEGF-C的相对表达量与临床病理特征之间的相关性

表2　胃癌组织中VEGF-C的表达与MVD的关系

3讨论

临床实践研究发现，多数早期胃癌在发病的初期并无明显的临床症状，在首次就诊时大部分胃癌患者已经进入中晚期，因此胃癌患者预后极差，生存率较低[4]。通过大量的临床研究发现，血管内皮生长因子-C是肿瘤调控中发挥生物学效应的重要分子，参与着各类肿瘤细胞的增殖凋亡、生长、发育以及侵袭转移，涉及到各类肿瘤的发生发展，同时也是目前研究肿瘤分子机制的热点内容[5-6]。肿瘤微血管新生是其浸润和远处转移的前提条件[7-8]，目前评价肿瘤血管生成的标准是测定肿瘤微血管密度(MVD)。而肿瘤微血管存在多种不同的模式，势必对肿瘤的进展及预后产生影响，但是有关微血管模式与肿瘤进展以及脉管内癌栓、局部肿瘤浸润等高危因素的以及预后的关系鲜见报道[9-10]。研究提示了VEGF-C可以用于对肿瘤预后的评估，其表达量与肿瘤的预后有着一定的相关性[11-12]。

近年来胃癌的发病率呈逐年上升的趋势，虽然治疗水平不断提高，但是患者的生存率并未得到明显提高，其转移与复发仍是其死亡的主要原因。国内外目前对胃癌的诊断研究主要集中在病因学、遗传基因、早期诊断手段的研究，治疗方面研究主要集中在放射、化学以及手术方法改进等方面，虽然取得了一定进展，但该病的发病率及死亡率并未得到明显降低，说明研究的深度尚不足，研究还处于基础阶段尚未应用于临床[11]。由于胃癌作为恶性肿瘤，对人类生命具有重大的威胁。因此，进一步寻找有关胃癌复发、转移生物标记物及敏感特异是该病有效治疗、提高生存率的关键点。其次做好胃癌发病的预防及早期发现，减少其发病率和转移率，是今后研究的重要方向[13]。VEGF-C具有增强微血管通透性，其特异性作用于血管内皮细胞，为肿瘤的浸润转移提供条件，刺激内皮细胞促进肿瘤血管生成。研究表明肿瘤细胞中VEGF-C的水平上调，具有促进肿瘤的生长的作用[14]。本研究通过分析VEGF-C在胃癌中的表达与微血管密度和淋巴结转移及胃癌发生发展及预后的关系，为胃癌的抗血管生成治疗研究提供理论依据。结果显示，VEGF-C相对表达量与患者的一般资料如年龄、性别、以及肿瘤的特征如大小、发病的部位、侵袭深度，肿瘤的分期及分化程度、是否远处转移等并不存在相关性；而淋巴受累方面，淋巴受累组的VEGF-C相对表达量明显上调，VEGF-C相对表达量明显上调与淋巴结受累转移的风险有关，同时发现VEGF-C表达水平与MVD差异表达具有相关性，对早期胃癌的诊断具有一定的作用。

综上所述，我们发现VEGF-C在胃癌表达上调，与淋巴结转移有着密切的相关性，提示VEGF-C可能与胃癌的转移侵袭等影响预后的因素有关，该分子差异性表达推测可能是胃癌早期的潜在靶点，但是本研究不足的是病例数还相对较少，VEGF-C在胃癌中的作用机制和靶基因生物学预测和阐明有待于进一步研究。

参考文献

[1]Zhang J，Guo SB，Duan ZJ.Application of magnifying narrow-band imaging endoscopy for diagnosis of early gastric cancer and precancerous lesion〔J〕.BMC Gastroenterol，2011，11：135.

[2]GASTRIC (Global Advanced/Adjuvant Stomach Tumor Research International Collaboration) Group，Paoletti X，Oba K，et al.Benefit of adjuvant chemotherapy for resectable gastric cancer：a meta-analysis〔J〕.JAMA，2010，303(17)：1729-1737.

[3]Washington K.7th edition of the AJCC cancer staging manual：stomach〔J〕.Ann Surg Oncol，2010，17(12)：3077-3079.

[4]Li ML，Zhang JC，Li SG，et al.Characteristic gene expression profiles in the progression from normal gastric epithelial cells to moderate gastric epithelial dysplasia and to gastric cancer〔J〕.Chin Med J(Engl)，2012，125(10)：1777-1783.

[5]Mees ST，Mardin WA，Wendel C，et al.EP300--a miRNA-regulated metastasis suppressor gene in ductal adenocarcinomas of the pancreas〔J〕.Int J Cancer，2010，126(1)：114-124.

[6]Kaemmerer D，Peter L，Lupp A，et al.Comparing of IRS and Her2 as immunohistochemical scoring schemes in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2012，5(3)：187-194.

[7]Ouyang G，Wang Z，Fang X，et al.Molecular signaling of the epithelial to mesenchymal transition in generating and maintaining cancer stem cells〔J〕.Cell Mol Life Sci，2010，67(15)：2605-2618.

[8]Jiang Z，Guo J，Xiao B，et al.Increased expression of miR-421 in human gastric carcinoma and its clinical association〔J〕.J Gastroenterol，2010，45(1)：17-23.

[9]Sun T，Wang C，Xing J，et al.MiR-429 Modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells〔J〕.Eur J Cancer，2011，47(17)：2552-2559.

[10]Chen L，Tang Y，Wang J，et al.miR-421 induces cell proliferation and apoptosis resistance in human nasopharyngeal carcinoma via downregulation of FOXO4〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2013，435(4)：745-750.

[11]Ohashi S，Natsuizaka M，Naganuma S，et al.A NOTCH3-m-

ediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors〔J〕.Cancer Res，2011，71(21)：6836-6847.

[12]Dominissini D，Moshitch-Moshkovitz S，Amariglio N，et al.

Adenosine-to-inosine RNA editing meets cancer〔J〕.Carcinogenesis，2011，32(11)：1569-1577.

[13]Moretta L，Locatelli F，Pende D，et al.Killer Ig-like receptor-mediated control of natural killer cell alloreactivity in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation〔J〕.Blood，2011，117 (3)：764-771.

[14]Yanaba K，Yoshizaki A，Asano Y，et al.IL-10-producing r-

egulatory B10 cells inhibit intestinal injury in a mouse model〔J〕.Am J Pathol，2011，178(2)：735-743.

(编辑：甘艳)

Relationship between VEGF-C Expression and Microvascular Density and Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer and Its Clinical Significance

ZHOUFengming，PENGQingdi.SichuanDazhouCentralHospital，Dazhou，635000

【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between VEGF-C expression and microvascular density，lymph node metastasis and development and prognosis of gastric cancer.Methods96 cases of patients treated with gastric cancer resection were collected， qPCR was used to detect relative expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) and microvessel density (MVD) parameters，and lymph node metastasis received correlation analysis.ResultsVEGF-C relative expression had no correlation with patient's general information such as age，sex，and tumor characteristics such as size，site of disease，depth of invasion，tumor stage and degree of differentiation，metastasis(P>0.05)；in lymphatic involvement，relative expression of VEGF-C of lymphatic involvement group significantly increased(P<0.05)，relative expression of VEGF-C of without lymph node involvement and the normal group had no statistically significant difference(P>0.05)，increase of VEGF-C expression was related to risk of lymph node involvement and metastasis；VEGF-C expression and differential expression of MVD were correlated.ConclusionVEGF-C relative expression level and lymph node metastasis and prognosis of gastric cancer have some relevance，but need to be further studied.

【Key words】Gastric cancer；Prognosis；VEGF-C；Microvessel density；Lymph node metastasis；Correlation

(收稿日期2015-11-19修回日期 2016-02-14)

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)04-0533-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.004