NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿根系生长及固氮特性的影响

范俊俊 ，刘晓静，李文卿

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中美草地畜牧业可持续发展研究中心甘肃 兰州　730070；2.甘肃省科技厅，甘肃 兰州　730030)



NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿根系生长及固氮特性的影响

范俊俊1，刘晓静1，李文卿2

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中美草地畜牧业可持续发展研究中心甘肃 兰州730070；2.甘肃省科技厅，甘肃 兰州730030)

摘要：【目的】 为了探明NO3--N/NH4+-N不同配比下紫花苜蓿根系生长及固氮特性，了解NO3--N与NH4+-N的最适配比，提高紫花苜蓿外源氮利用效率.【方法】 室外防雨网室内，以‘甘农3号’为研究材料，采用盆栽营养液沙培法，在氮素水平210 mg/L下，设NO3--N和NH4+-N的7个混合配比(1∶7、1∶3、3∶5、5∶5、5∶3、3∶1、7∶1)，测定处理后紫花苜蓿各生育期根系相关指标.【结果】 全生育期内，不同氮素形态配比下(NO3--N/NH4+-N)紫花苜蓿的根系生物量、根系总长度和根表面积均在NO3--N/NH4+-N配比为5∶3处理下显著高于其他处理；根瘤数、根瘤质量和固氮酶活性在紫花苜蓿生长的前中期(苗期和现蕾期)均在NO3--N/NH4+-N配比为1∶7处理下最大，而中后期(盛花期、结荚期和成熟期)在NO3--N/NH4+-N配比5∶3处理下达到最大值.整个生育期，各处理下紫花苜蓿的根系生物量差异显著，而根系总长度、根表面积、根瘤数、根瘤重在前中期差异显著，而后期差异不大.【结论】 NO3--N和NH4+-N均能促进紫花苜蓿各时期根系生长，但二者混合使用且NO3--N/NH4+-N比例为5∶3时，紫花苜蓿根系生长最好，肥料报酬率高.与此同时，紫花苜蓿自身固氮能力也最强，对氮素的利用率达到最高.

关键词：紫花苜蓿；氮素形态配比；根系特性；固氮特性

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)为多年生优质豆科草本植物，可以与根瘤菌有效共生进行生物固氮，从而为植株提供氮素，是畜牧业生产中不可或缺的植物蛋白资源.但根瘤的形成受生态环境与土壤肥力的影响较大[1]，仅靠生物固氮远不能满足其氮素需求，还必须施用氮肥，尤其是在以高产优质为目的的生产中，施氮对其增产效果显著.其原因为充足的氮满足了高产紫花苜蓿品种对氮素的较高要求，同时促进了其根系等器官的良好生长[2].根系的形态特征和生理生化反应与其氮素的利用效率极为相关，其发育程度与植株生物量关系密切[3]，紫花苜蓿根系的生长状况直接决定着其产草量.

目前关于外源氮素形态对植物根系影响的研究主要集中在非豆科植物.研究表明，NO3--N可以促进拟南芥根系的长度生长以及表面积增大和密度的增加[4]，NH4+-N处理明显地促进水稻地上部的生长，而NO3--N促进水稻根的生长，NH4+-N能促进植物侧根和根毛的生长.孙敏等[5]研究表明NH4+-N处理下小麦的根体积、根系生物量、根系活力均大于NO3--N处理.宋海星等[6-7]、Streeter等[8]研究发现NH4+-N 、NO3--N形态不同，豆科作物根瘤形成和固氮能力不同，直接影响其氮代谢能力，且NH4+-N对根瘤固氮的抑制作用明显低于NO3--N.本课题组前期研究发现，在苗期，NH4+-N培养下紫花苜蓿根瘤数量和固氮酶活性均明显好于NO3--N 培养[9]，同时也发现，NO3--N与NH4+-N混合配施对紫花苜蓿各生育期的生长影响好于两者单施[10].目前，针对氮素不同配比对紫花苜蓿根系生长及固氮特性影响的研究鲜有报道.鉴于此，本试验以NO3--N/NH4+-N混合营养液为氮素来源，结合砂培法，模拟土壤中NO3--N/NH4+-N的不同配比，以期了解NO3--N和NH4+-N的最适配比，探明NO3--N/NH4+-N不同配比下紫花苜蓿根系生长及固氮特性，为提高紫花苜蓿外源氮利用效率提供科学依据.

1材料与方法

1.1供试材料

供试紫花苜蓿品种：‘甘农3号’紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.‘Gannong No.3’)，供试菌株为中华根瘤菌(12531)，苜蓿根瘤和诱变菌株，均由甘肃农业大学草业学院提供.

1.2试验设计

选用直径32 cm、高20 cm的花盆，装入经自来水冲洗再用蒸馏水清洗并经过高温灭菌的粗砂10 kg.每盆播种100粒灭菌种子，播种14 d后进行间苗，每盆定苗50株，然后浇入营养液，置于室外防雨网室内.本试验根据前期试验结果[9]设氮素水平为210 mg/L(以纯氮计)，设NO3--N、NH4+-N两种氮素形态7种配比，NO3--N/NH4+-N分别为12.5∶87.5；25∶75；37.5∶62.5；50∶50；62.5∶37.5；75∶25；87.5∶12.5，即：1∶7、1∶3、3∶5、5∶5、5∶3、3∶1、7∶1，共7个处理，每处理重复15次，完全随机排列.以Fahraeus无氮植物营养液为基本营养液，分别加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素质量浓度，并调节pH值为7，结合无氮营养液一同施入.

2014年4月10日播种，播种初期每日喷浇3次蒸馏水，每次100 mL，直至对生真叶完全展开；防止盐分积累，之后每7 d用蒸馏水充分淋洗，再重新加入营养液500 mL.长至3片复叶时，每盆接种根瘤菌液50 mL.

1.3采样时期的划分

苗期：有80%的植株开始分枝时；现蕾期：有15%以上的植株在叶腋间已形成花蕾时；盛花期：有75%左右的分枝开始开花；结荚期：有10%以上的分枝花序已结荚；成熟期：有80%以上的果实成熟.

1.4测定指标与方法

根系生物量：用滤纸吸干地下部水分，放入烘箱105 ℃下杀青15 min后，于65～75 ℃烘干至恒质量，每个处理重复6次；根系总长度、根表面积、根平均直径：测定时将各处理的根系用清水洗净，采用台式扫描仪(EPSON Experssion)和WinRHIZO 根系分析系统软件(Regent Instruments,Inc.,Quebec,Canada) 进行数据采集，每个处理重复6次；根瘤数：统计单株根瘤数，每处理取10株；根瘤质量：将每个单株上摘下的根瘤在电子天平上称其鲜质量，每个处理重复10次；固氮酶活性：采用乙炔还原法测定[11-12].

式中：hx：实际C2H4峰面积；C：标准C2H4水平，μmol/mL)；hs：标准C2H4峰面积，t：C2H2反应时间；m：瘤质量.

1.5数据处理

采用Excel 2003软件进行数据整理，并用SPSS 17.0进行方差分析.

2结果与分析

2.1NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿各生育期根系生物量的影响

由图1可知，在氮素水平210 mg/L不同氮素形态配比处理下，紫花苜蓿的根系生物量随着生育期的推进呈逐渐增加的趋势，苗期至结荚期根系生物量快速增加，而结荚期至成熟期增速缓慢，在成熟期达到峰值，成熟期随着根系的衰老，部分根系生物量也明显减少.从同一生育时期来看，不同配比处理下各处理间差异显著(P<0.05).苗期，NO3--N/NH4+-N配比为1∶7时，根系生物量显著高于其他处理(P<0.05)；现蕾期，NO3--N/NH4+-N为1∶3和1∶7处理时，显著高于其他处理(P<0.05)，但两者差异不显著.至盛花期，根系生物量随着NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比列的增大有所下降，在NO3--N/NH4+-N为5∶3处理下达到最大.结荚期和成熟期，根系生物量均表现为NO3--N比例高的处理较高，且在NO3--N/NH4+-N为5∶3时显著高于其他处理(P<0.05).

图中的不同字母表示同一时期处理间差异达到5%显著水平.图1　氮素形态配比对紫花苜蓿不同生育期根系生物量的影响Fig.1　Effects of NO3--N/NH4+-N on the underground biomass of alfalfa at different growth stages

2.2NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿各生育期根系总长度的影响

从图2可知，随着生育期的推进，各处理下紫花苜蓿的根系总长度呈现先增加后减小的变化趋势，在结荚期最大.苗期，NO3--N/NH4+-N为5∶3时根系总长度最大，5∶5处理最小，而其余各处理间(除3∶5处理)差异不显著(P<0.05).现蕾期，NO3--N/NH4+-N 5∶3处理下紫花苜蓿根系总长度显著大于其他处理(P<0.05).至中后期(盛花期、结荚期和成熟期)，外源混合氮中NO3--N比列高时，根系总长度较长.整个生育期，NO3--N/NH4+-N比例为5∶3时，紫花苜蓿的根系总长度最长.

2.3NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿各生育期根系表面积的影响整个生育期，在氮素水平210 mg/L下，紫花苜蓿根系表面积由苗期至现蕾期快速增加，现蕾期至结荚期增加缓慢，结荚期达到最大，至成熟期略有减小，整体呈先增加后减小的趋势(图3).全生育期，不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿根表面积均在NO3--N/NH4+-N比例为5∶3时显著大于其他处理(P<0.05).苗期，5∶3处理下根系表面积最大，5∶5处理下最小.现蕾期，除1∶7和5∶3处理外，其他处理间差异不显著(P>0.05).结荚期和成熟期，除5∶3处理外，其他处理间差异不显著(P>0.05).

图2　氮素形态配比对紫花苜蓿不同生育期根系总长度的影响Fig.2　Effects of NO3--N/NH4+-N on the total root length of alfalfa at different growth stages

图3　氮素形态配比对紫花苜蓿不同生育期根系表面积的影响Fig.3　Effects of NO3--N/NH4+-N on the root surface area of alfalfa at different growth stages

2.4NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿各生育期根瘤数的影响

随着生育期的推进紫花苜蓿的根瘤数呈现先增大后减小的趋势，在盛花期达到最大值，然后迅速降低(图5).苗期和现蕾期，不同氮素形态配比处理下紫花苜蓿根瘤数表现为：NH4+-N比例高于NO3--N时根瘤数多，且NO3--N/ NH4+-N为1∶7时最高，但各处理间差异不显著(P>0.05).盛花期，结荚期和成熟期，随着混合态氮中NO3--N比例的升高，紫花苜蓿根瘤数先增加后减少，在NO3--N/NH4+-N配比为5∶3处理下显著高于其他处理(P<0.05).

图4　氮素形态配比对紫花苜蓿不同生育期根瘤数的影响Fig.4　Effects of NO3--N/ NH4+-N on root nodule number of alfalfa at different growth stages

2.5NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿各生育期根瘤质量的影响

由表1可以看出，随着生育期的推进紫花苜蓿的根瘤质量呈现先增大后减小的趋势，在盛花期达到最大值，然后迅速降低.苗期和现蕾期，不同氮素形态配比处理下紫花苜蓿根瘤质量表现为：NH4+-N比例高于NO3--N时较高，且NO3--N/ NH4+-N为1∶7时最高，但各处理间差异不显著(P>0.05).盛花期，结荚期和成熟期，随着混合态氮中NO3--N比例的升高，紫花苜蓿根瘤质量先增大后减小，在NO3--N/NH4+-N配比为5∶3处理下显著高于其他处理(P<0.05)，而NO3--N/NH4+-N>5∶3时有所下降.

2.6NO3--N/NH4+-N配比对紫花苜蓿各生育期固氮酶活性的影响

从表2中可以看出，整个生育期，各处理下紫花苜蓿的固氮酶活性均随着生育期的推进呈现先增大后减小的变化趋势，在结荚期取得最大值.苗期和现蕾期紫花苜蓿的固氮酶活性表现为：NO3--N/NH4+-N<5∶5时，固氮酶活性较高，各配比间差异显著(P<0.05)，苗期最高值出现在1∶7处理时，现蕾期最高值则为1∶7和5∶3处理.盛花期，NO3--N/NH4+-N配比为5∶3时，固氮酶活性显著高于其他处理(P<0.05) ，与最低值7∶1处理相比增加了67.8%.结荚期和盛花期，NO3--N/NH4+-N配比为5∶3和7∶1时，固氮酶活性均显著高于其他处理(P<0.05).

由此可见，紫花苜蓿中后期NO3--N/NH4+-N为5∶3时，自身固氮能力较强.

表1　氮素形态对紫花苜蓿不同生育期根瘤质量的影响

同列数据肩标不同字母表示差异达5%水平.

表2　氮素形态对紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性的影响

3讨论与结论

3.1氮素形态配比对紫花苜蓿根系生长的影响

本研究表明，外源氮素形态配比对紫花苜蓿的根系生长的影响较大，在氮素质量浓度210 mg/L时不同氮素形态配比下紫花苜蓿的根系特性整体表现为：前期NH4+-N比例大时较好，而中后期NO3--N比例大时紫花苜蓿的根系生物量、根系总长度和根表面积均较好；分析原因可能是紫花苜蓿吸收NO3--N时需先将其转化为NH4+-N才能直接吸收利用，且此过程需要消耗能量，而NH4+-N可直接吸收利用，因此，前期NH4+-N更有利于紫花苜蓿根系的生长发育.刘晓静等[2]对紫花苜蓿的研究中发现NH4+-N培养下苗期生长优于NO3--N培养，根长、根体积和根干质量均明显好于NO3--N培养也证实了这一点.另外，NO3--N与NH4+-N二者以一定的比例混合使用更有利于根系的生长以及根表面积的增加[10]，本研究结果也表明，整个生育期，混合态氮中NO3--N/NH4+-N比例为5∶3时，紫花苜蓿根系生长发育最好，分析原因可能是因为NH4+-N含量极高或纯NH4+-N时，大量的NH4+-N来不及利用和转移，在体内积累过多使植物的呼吸作用降低，根系生长受到限.相反，NO3--N的还原需要硝酸还原酶，且其运输是与细胞膜H+-ATPase相偶联的次级主动运输，需要消耗ATP，因此，单一NO3--N也会影响根系的生长.而NO3--N和NH4+-N同时存在于生长的介质中会相互影响彼此的吸收速率及吸收动力学，在氮素供应充足的情况下(尤其硝态氮)，NO3--N可以促进植物对NH4+-N的吸收[13]，根系多吸收了铵态氮，从而促进了根系的生长[14]，杨阳等[15]、张辰明等[16]和Saravia等[17]等的研究结果也证明了这一点.

3.2氮素形态配比对紫花苜蓿结瘤固氮的影响

根瘤的生长不仅受土壤酸碱度、水分等因素的影响，而且也受外源氮素的制约[18].因此，不同氮素形态会影响豆科植物根瘤的形成与生长，固氮能力和产量.NO3--N和NH4+-N同时存在于生长的介质中时，会表现出联合效应，促进紫花苜蓿结瘤固氮[10]，本研究发现，同一氮素水平不同形态配比下，紫花苜蓿的根瘤数、根瘤质量和固氮酶活性在苗期和现蕾期均表现为1∶7处理最好，说明NH4+-N更有利于根瘤的生长，此结果与氮素形态对大豆结瘤固氮影响一致[19-20]，分析原因有两方面：其一，可能是供给NO3--N 时主要影响根瘤呼吸速率使根瘤皮层内O2扩散阻抗力增大，根瘤侵染区细胞O2浓度降低，类菌体呼吸和固氮所需氧供应不足，因而导致根瘤生长受到抑制[7].其二，可能是由于同化NO3--N的关键酶-NR与固氮酶对钼存在竞争性，减少了钼铁蛋白的形成，从而降低了共生固氮的固氮酶活性[20].紫花苜蓿生长至中后期(盛花期至成熟期)，NH4+-N比例大的处理紫花苜蓿的根瘤数、根瘤质量下降，说明随着培养时间的延长，NH4+-N抑制了根瘤的生长，贾彦博等[21]的研究也证明了这一点.根瘤数、根瘤质量和固氮酶活性均表现为5∶3处理下最好，分析原因可能是大量的NH4+-N来不及利用和转移，在高离子浓度下会导致植物中毒，不能形成根瘤进而限制固氮酶的合成.此外，结荚期后各处理下的根瘤数和根瘤质量整体呈现减小的变化趋势，可能是因为在生长后期补充外源氮的供给抑制根瘤的生长，董守坤等[22]在大豆的研究中也得出了同样的结论.

综上所述，NO3--N和NH4+-N均能促进紫花苜蓿各时期根系生长，但二者混合使用且NO3--N/NH4+-N比例为5∶3时，紫花苜蓿根系生长最好，肥料报酬率高.与此同时，在该配比下紫花苜蓿自身固氮能力也最强，对氮素的利用率达到最高.

参考文献

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(责任编辑赵晓倩)

Effects of NO3--N/NH4+-N ratios on root growth and nitrogen-fixation characteristics of alfalfa

FAN Jun-jun1,LIU Xiao-jing1，LI Wen-qing2

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education，Sino-U.S.Centers for Grazing Land Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China;2.Gansu Provincial Sci.& Tech.Department,Lanzhou 730030,China)

Abstract：【Objective】 To ascertain the root characteristic and nitrogen fixation characteristics of Medicago sativa (cv.‘Gannong No.3’) and find out the optimum ratio,improving the utilization efficiency of exogenous nitrogen.【Method】 Under the condition of nutrient solution and the nitrogen level of 210 mg/L (pure nitrogen),the effect of 7 ratios of NO3--N/NH4+-N (1∶7,1∶3,3∶5,5∶5,5∶3,3∶1,7∶1) on root characteristics and nitrogen fixation characteristics of the alfalfa were studied outdoors during the whole growth stage by sand culture method,determination of related parameters of the growth period of the root system after processing.【Result】 The root biomass,root total length and root surface area of alfalfa at ratio of 5∶3 treatment were all significantly higher than those of other treatments during the whole growth stage.The maximum of nodule number,nodule weight and nitrogenase activity were 1∶7 treatment before the mid-stages (seeding and budding) and 5∶3 treatment after the mid-stages (flowering,seed podding and maturing).During the whole growth stage,each treatments of alfalfa root biomass has significant differences,but root total length,root surface area,nodule number and nodule weight has significant differences before the mid-stages,and their has no significant differences after the mid-stages.【Conclusion】 NO3--N and NH4+-N can promote alfalfa root growth each time,but both mix proportion and NO3--N/NH4+-N is 5∶3,alfalfa root growth,the best fertilizer return rate is high.At the same time,under the ratio of alfalfa and nitrogen fixation ability is strongest,reached the highest utilization rate of nitrogen.

Key words：Medicago sativa；NO3--N/NH4+-N；Root characteristics；Nitrogen fixation characteristics

通信作者：刘晓静，女，博士，教授，研究方向为牧草(草坪草)营养生理.E-mail：liuxj@gsau.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(31460622)；甘肃省财政厅项目“外源氮素供应对紫花苜蓿产量和品质形成影响研究”.

收稿日期：2015-03-10；修回日期：2015-04-29

中图分类号：S 541+.1

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)01-0114-06

第一作者：范俊俊(1989-)，男，硕士研究生，主要从事牧草及草坪营养生理研究.E-mail：fan1990124@163.com