艾拉莫得治疗大鼠胶原诱导性关节炎的疗效及可能机制

邹惠美　成沛玉　王　蓉

(南华大学护理学院，湖南　衡阳　421001)



艾拉莫得治疗大鼠胶原诱导性关节炎的疗效及可能机制

邹惠美成沛玉1王蓉

(南华大学护理学院，湖南衡阳421001)

〔摘要〕目的探讨艾拉莫得(T-614)对胶原诱导关节炎(CIA)模型大鼠的治疗作用及可能机制。 方法通过牛Ⅱ型胶原(CⅡ)和不完全弗氏佐剂混合的胶原乳剂免疫大鼠，建立CIA模型，CIA大鼠随机被分为模型组、甲氨蝶呤(MTX)组、T-614高剂量组和T-614低剂量治疗组。其中药物干预组大鼠分别用甲氨蝶呤、高剂量T-614和低剂量T-614连续干预3 w。关节炎指数(AI) 评分评价大鼠关节炎发病程度，HE染色观察大鼠踝关节组织病理学改变，应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清中抗CⅡ-IgG抗体及其两种亚型IgG1、IgG2a的抗体滴度，ELISA试剂盒检测血清白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ水平。 结果药物干预3 w后，与模型组相比，T-614高剂量组的AI评分、病理学评分、IgG及其亚型IgG1、IgG2a的抗体滴度和3种细胞因子含量均降低(P<0.05)。 结论T-614能够积极改善CIA大鼠关节炎的症状，并可能通过降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性细胞因子和IgG抗体的表达而发挥抑制关节炎症病程发展的作用。

〔关键词〕艾拉莫得；胶原性诱导关节炎；抗CⅡ-IgG抗体；炎性细胞因子

类风湿关节炎(RA)可导致关节畸形严重影响患者的生活质量〔1〕。RA的基本病理特征是炎症细胞浸润、滑膜细胞大量增殖和血管翳的生成，并最终引起关节软骨和骨质的破坏。而T淋巴细胞的活化及其炎性细胞因子表达的增加在RA的疾病发展过程中起到了非常重要的作用〔2〕。艾拉莫德(T-614)是全球第一个具有我国完全自主知识产权的抗风湿新药，目前该药已于2011年经国家批准上市并在临床上用于治疗RA且取得了良好的效果〔3〕。T-614在治疗RA过程中所发挥药理作用的相关实验研究报道甚少，不同剂量的T-614对抑制RA炎症反应的机制仍不明确。本实验拟通过观察T-614对胶原活导关节炎(CIA)大鼠的治疗作用，探究其对CIA大鼠淋巴细胞活化及其炎性细胞因子表达影响的作用机制。

1材料和方法

1.1实验动物SPF级雌性Wistar成年大鼠50只，体重(170±10)g。饲养条件：SPF级动物房，光照/黑暗:12 h/12 h，标准饲料，清洁饮水。动物适应性饲养1 w。

1.2主要试剂及药物牛Ⅱ型胶原(CⅡ，Sigma公司)，不完全弗氏佐剂(Sigma公司)；甲氨蝶呤片(上海信谊药厂有限公司)，艾拉莫得片(南京先声药业有限公司)；抗大鼠免疫球蛋白G(IgG) 抗体及抗大鼠IgG1、IgG2a 抗体(Bethyl公司)；白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α及γ干扰素(IFN-γ) 的ELISA试剂盒(Bender-MedSystems公司，奥地利)。

1.3造模与分组50只大鼠预先制备CIA模型。以牛CⅡ与不完全弗氏佐剂制备成终浓度为2 g/L的免疫混合乳剂，于每只大鼠尾根部皮内注射免疫乳剂150 μl，同样的方法于7 d后加强免疫1次。初次免疫后第10天起每天观察造模大鼠关节炎的发病情况，并行关节炎指数(AI)评分。共有43只造模大鼠第1次AI评分≥5分，显示造模成功，从其中选取40只随机分成模型组、MTX组、T-614高剂量组和T-614低剂量组，每组各10只。初次免疫第14天起开始灌胃，MTX组给予MTX灌胃(2.5 mg·kg-1·w-1)，T-614高剂量组给予10 mg·kg-1·d-1T-614灌胃，T-614低剂量组给予5 mg·kg-1·d-1T-614灌胃，模型组给予生理盐水作为对照。灌胃连续3 w，直至初次免疫第34天。

1.4AI评分初次免疫后第10天起对造模大鼠关节炎进行评分。评分标准依照AI 0～4级评分法〔3〕。于初次免疫第10天起直至第34天每4天记录1次关节炎评分。

1.5病理形态学观察及评分各组大鼠于灌胃3 w后(初次免疫后第34天)取血后处死，取大鼠踝关节置于4%多聚甲醛中固定16 h，10%乙二胺四乙酸溶液中脱钙，脱水、包埋，切片，行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察关节组织病理变化。病理评分标准参照Tsubaki等〔4〕于2005年提出的评分方法。

1.6血清中抗CⅡ-IgG及其亚型抗体和炎性细胞因子的检测分离大鼠血清，应用ELISA法检测血清中抗CⅡ-IgG及其两种亚型IgG1、IgG2a的抗体滴度，在450 nm波长下测定光密度值；分别应用IL-1β、TNF-α和IFN-γ的ELISA试剂盒对大鼠血清中的IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平进行检测，操作过程严格按照说明书执行。

1.7统计学分析采用SPSS16.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1各组大鼠体重变化及AI评分实验结束时模型组、MTX组、T-614高剂量组和T-614低剂量组大鼠体重比免疫前分别增加了(7.8±5.1) g、(19.8±7.3)g、(20.5±7.9) g和(18.1±6.7) g ；虽然各治疗组的大鼠体重增加都大于模型组，但差异均没有统计学意义(P>0.05)。实验结束时模型组、MTX组、T-614高剂量组和T-614低剂量组大鼠AI评分分别为(7.600±1.694)、(3.700±1.473)、(3.100±0.548)、(3.900±1.176)，与模型组比较，其他各组AI评分均显著降低(P<0.05)。初次免疫后第10天、14天、18天、22天、26天、30天、34天关节炎评分，见表1。

表1　各组CIA大鼠关节炎评分

与模型组比较:1)P<0.05，下表同

2.2各组大鼠关节病理形态改变及病理评分HE染色结果显示模型组有大量炎症细胞浸润，同时伴有滑膜细胞增生和血管翳生成，部分软骨及骨质有明显破坏。而MTX组和T-614各治疗组炎症细胞浸润和滑膜细胞增生较轻，少见血管翳生成，软骨和骨质破坏不明显。与模型组相比，T-614高剂量组可明显抑制病变的发展(P<0.05)。见图1和表2。

图1　各组大鼠关节病理学改变(HE)

组别总分滑膜增生炎细胞浸润新生血管模型组0.742±0.0790.482±0.0020.197±0.0530.281±0.159MTX组0.653±0.1291)0.287±0.1491)0.171±0.0280.218±0.1521)T-614高剂量组0.581±0.1171)0.226±0.1211)0.049±0.0061)0.203±0.1391)T-614低剂量组0.657±0.1201)0.389±0.1841)0.051±0.0211)0.278±0.193

2.3各组大鼠血清中抗CⅡIgG及其亚型IgG1、IgG2a水平在模型组、MTX组、T-614高剂量组和T-614低剂量组大鼠血清中，抗CⅡIgG滴度的光密度值分别为1.82±0.84、1.32±0.57、1.17±0.63和1.59±0.93，虽然T-614低剂量组与模型组相比较低，但各组间差异无统计学意义，而T-614高剂量组则明显低于模型组(P<0.05)；亚型IgG1分别为0.36±0.17、0.23±0.11、0.14±0.03及0.33±0.14，T-614高剂量组相对于模型组明显降低(P<0.05)，而T-614低剂量组和模型组之间没有明显差异；亚型IgG2a分别为0.87±0.63、0.51±0.34、0.43±0.31 和0.46± 0.28，相比模型组，T-614高剂量组和T-614低剂量组都明显降低(P<0.05)。

2.4各组大鼠血清细胞因子水平通过药物干预后，MTX组、T-614高剂量组和T-614低剂量组的血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ含量均明显低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3　各组大鼠血清IL-1β、TNF-α和

3讨论

RA是自身免疫性疾病的典型代表之一，T细胞异常活化，分化为不同功能的亚群，产生大量炎性细胞因子，导致关节损害〔5，6〕。IL-1β、TNF-α和IFN-γ是RA致病的关键因子，与RA病程进展密切相关〔7〕。

T-614是国家食品药品监督管理局临床批准的Ⅰ类新药，于2011年8月获得中国食品药品监督管理局批准，用于治疗成人活动性RA〔8〕。在T-614的相关基础研究中发现，T-614对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α等炎性因子水平的上调有显著抑制作用〔9〕。本结果显示两种不同剂量T-614治疗组中血清中IL- 1β、TNF-α和IFN-γ的水平均显著降低，其中高剂量组更显著。高剂量T-614可明显减轻关节的炎症细胞浸润、滑膜细胞增殖、血管翳生成和骨质破坏，可见T-614对CIA病程进展的抑制作用。

同时RA是一种T细胞活化异常的自身免疫病，其中抗CⅡ抗体IgG两种亚型的表达就与Th1、Th2有着非常紧密的联系。Th1可以促进IgG2a的产生，而Th2则促进IgG1的产生〔10〕。艾拉莫德不仅能够抑制载脂蛋白Ⅱ抗体水平而且还能分别调控免疫球蛋白亚群的水平，并呈剂量依赖性〔11〕。本研究结果说明T-614可以抑制T细胞免疫反应从而发挥治疗作用。而低剂量的T-614只能影响IgG2a的水平，这提示IgG2a可能在T-614对CIA的抑制机制中发挥着中心作用。

不同于传统的非甾体抗炎药，T-614对禁食老鼠没有表现出消化道溃疡类的不良反应〔12〕，在2期临床试验过程中，患者的常见不良反应的发生率明显低于对照组尼美舒利，这也证实T-614有更好的耐受性和安全性〔13〕。胶原诱导关节炎大鼠模型的炎症呈持续性发展，并且没有自限倾向，这些特征甚至包括某些临床表现都非常接近于人类RA〔14〕，因此本实验也采用了这种动物模型。

4参考文献

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3刘丹,陈妤,丁汉飞,等.艾拉莫德(T-614) 在类风湿关节炎基础实验与临床疗效的研究进展〔J〕.中国新药杂志,2013;22(9):1052-5.

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8郝春芳,刘毅,赵毅.艾拉莫德在类风湿关节炎治疗中的研究〔J〕.华西医学,2013;28(5):795-8.

9蒋叶,吕伟,余书勤.艾拉莫德对脂多糖激活大鼠肺泡巨噬细胞系TNFA产生及NF-JB活性的抑制作用〔J〕.药学学报,2006;41(5):401-5.

10Hayashi T,Shimoyama N,Mizuno T,etal.Destruction of salivary and lacrimal glands by Th1-polarized reaction in a model of secondary Sjögren's syndrome in lupus-prone female NZB×NZWF(1) mice〔J〕.Inflammation,2012;35(2):638-46.

11Du F,Lü LJ,Fu Q,etal.T-614,a novel immunomodulator,attenuates joint inflammation and articular damage in collagen induced arthritis〔J〕.Arthritis Res Ther,2008;10(6):1-11.

12Ishiguro N,Yamamoto K,Katayama K,etal.Iguratimod-Clinical Study Group Concomitant iguratimod therapy in patients with active rheumatoid arthritis despite stable doses of methotrexate:a randomized,double-blind,placebo-controlled trial〔J〕.Mod Rheumatol,2013;23(3):430-9.

13魏伟,张玲玲,肖峰,等.艾拉莫德治疗类风湿关节炎Ⅱ期临床试验〔C〕.武汉：第十二次全国临床药理学学术会议论文集,2010.

14Kogure M,Mimura N,Ikemoto H,etal.Moxibustion at mingmen reduces inflammation and decreases IL-6 in a Collagen-induced arthritis mouse model〔J〕.Acupunct Meridian Stud,2012;5(1):29-33.

〔2014-11-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R6

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.017

通讯作者：成沛玉(1967-)，女，硕士，主任护师，硕士生导师，主要从事护理管理、教学及相关科研工作。

1湘潭市第一人民医院

第一作者：邹惠美(1989-)，女，在读硕士，主要从事护理管理、教学及相关科研工作。