TLR4抑制剂Tak-242对慢性盆腔炎大鼠炎症指标及病理形态学改变的影响

王春梅　康　燕　靳紫薇　魏顺英　黄华民

(青海红十字医院妇二科,青海　西宁　810001)



TLR4抑制剂Tak-242对慢性盆腔炎大鼠炎症指标及病理形态学改变的影响

王春梅康燕靳紫薇魏顺英黄华民

(青海红十字医院妇二科,青海西宁810001)

〔摘要〕目的探讨Toll样受体(TLR)4抑制剂Tak-242对慢性盆腔炎大鼠炎症指标及病理形态学改变的影响。方法采用向60只SD大鼠子宫注射苯酚胶浆的方法制备慢性盆腔炎模型，随机分为4组(每组15只)：模型组、Tak-242低剂量组、Tak-242中剂量组和Tak-242高剂量组；Tak-242低、中、高剂量组则在造模后第8天开始腹腔注射0.1、0.3和1 mg/kg Tak-242，隔日1次，连续4 w；模型组则注射等体积生理盐水。另选取15只同周龄SD大鼠作正常对照(对照组)。待治疗结束后检测各组大鼠血清炎症因子〔肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-1β和高敏c-反应蛋白(hs-CRP)〕、免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)水平和免疫细胞功能(T细胞百分率、淋转率和脾细胞NK活性)，取出子宫后进行病理形态学观察。 结果与对照组相比，模型组的TNF-α、IL-6、IL-1β、hs-CRP及子宫病理评分均升高，IgG、IgA、T细胞百分率、淋转率及NK细胞活性均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；Tak-242腹腔注射治疗后可改善上述指标，Tak-242中、高剂量组的上述指标均优于模型组(P<0.05)，且高剂量组的上述指标水平均优于低、中剂量组(P<0.05)。结论Tak-242可抑制慢性盆腔炎大鼠的炎症反应，改善免疫功能及子宫病理改变，抑制TLR4通路可能成为慢性盆腔炎治疗的新策略。

〔关键词〕Toll样受体4；Tak-242；慢性盆腔炎；炎症指标；病理形态

随着宫腔镜操作普及、人工流产次数增多及性传播疾病的泛滥，慢性盆腔炎的发病率上升且趋于年轻化〔1〕。目前对于慢性盆腔炎尚无特效疗法，反复治疗及过多抗生素使用可导致盆腔免疫功能紊乱，有效控制炎症反应及继发性炎症性病理损害是治疗该病的关键〔2〕。Toll样受体(TLR)4)信号通路被认为是炎症的重要信号因子，可识别受损细胞释放的内源性配体，进而引发一系列的炎症反应〔3〕。多项研究表明，多种抗炎药可通过抑制TLR4通路发挥抗炎效果〔4,5〕，但抑制TLR4通路能否改善慢性盆腔炎的炎症反应及炎症性病理损害，国内外尚无相应文献报道。本研究采用TLR4抑制剂Tak-242治疗慢性盆腔炎大鼠模型，观察对其炎症反应及子宫病理形态学的影响。

1材料与方法

1.1仪器与试剂肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-1β和高敏c-反应蛋白(hs-CRP)酶联免疫检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)检测试剂购自上海科华公司，MK3型酶标仪为Thermo公司产品，7600-110型全自动生化分析仪为日本日立公司产品，FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2动物与分组取60只SPF级SD大鼠(体重200~220 g，购自北京维通利华公司)制备慢性盆腔炎模型，随机分为4组(每组15只)：模型组、Tak-242低剂量组、Tak-242中剂量组和Tak-242高剂量组。同时选取15只同周龄的SD大鼠作正常对照(对照组)。Tak-242低、中、高剂量组在造模后第8天开始腹腔注射0.1、0.3和1 mg/kg Tak-242，隔日1次，连续4 w；模型组注射等体积的生理盐水。所有大鼠的饲养环境及饲料相同，每笼按5只饲养，室内昼夜温度(23±2)℃，湿度60%~70%，12 h/12 h明暗周期。

1.3慢性盆腔炎模型制备在饲养1 w后进行造模，禁食、禁水8 h后，采用3%戊巴比妥钠腹腔注射，充分麻醉后取仰卧位，将大鼠四肢固定在操作台上，作长约1 cm的腹部正中切口，开腹后将双侧子宫暴露并固定，选用4号针头于子宫分叉处进入宫腔内，朝卵巢方向缓慢推注0.1 ml苯酚胶浆，造模完成后关闭腹腔，术区消毒。对照组仅行开腹手术及子宫暴露，不行腹腔注射。所有手术操作均严格遵循无菌操作原则。

1.4炎症因子水平检测采用酶联免疫吸附法。末次给药后禁食12 h，次日腹主动脉取血5 ml，以3 000 r/min(离心半径为10 cm)离心10 min后，收集上清后采用TNF-α、IL-6、IL-1β和hs-CRP试剂盒检测，操作均严格遵循试剂盒说明书。

1.5免疫球蛋白水平及免疫细胞功能检测采用免疫浊度法检测血清IgG、IgA和IgM水平，酸性非特异性酯酶染色法检测T细胞百分率，体外植物血凝素(PHA)刺激的形态学法检测淋转率，流式细胞术检测鼠脾NK细胞杀伤YAC细胞活性。

1.6病理形态学观察待大鼠处死后，打开腹腔观察腹腔积液及子宫情况，记录子宫色泽、形状、弹性、有无炎性包块及与周围组织有无粘连，游离子宫后将其切除，置于10%中性甲醛溶液中固定，常规HE染色后进行观察。采用四分类法进行病理评分：按照由轻至重将子宫粘连或扩张、上皮变性坏死、慢性炎症浸润、内膜充血水肿及上皮细胞增生赋值为0~3分。病理形态评分由两位病理科医师采用双盲法完成。

2结果

2.1各组大鼠的血清炎症因子水平比较与对照组相比，模型组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β和hs-CRP水平均降低(P<0.05)；Tak-242低、中和高剂量组的上述4个炎症因子水平均低于模型组，且高剂量组的炎症因子水平均优于低、中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠的血清炎症因子及免疫球蛋白水平比较±s,n=15)

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与Tak-242低剂量组比较：3)P<0.05；与Tak-242中剂量组比较：4)P<0.05；下表同

2.2各组大鼠的血清免疫球蛋白水平比较与对照组相比，模型组的血清IgG和IgA水平均降低(P<0.05)；Tak-242中、高剂量组的血清IgG和IgA水平均高于模型组，且高剂量组的炎症因子水平均优于低、中剂量组(P<0.05)；各组血清IgM水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3各组大鼠的免疫细胞功能比较与对照组相比，模型组的T细胞百分率、淋转率和NK细胞活性均降低(P<0.05)；Tak-242中、高剂量组的上述指标水平均高于模型组，且高剂量组的T细胞百分率、淋转率和NK细胞活性均优于低、中剂量组(P<0.05)。见表2。

2.4各组大鼠的子宫病理改变评分比较与对照组相比，模型组的粘连或扩张、上皮变性坏死、慢性炎症浸润、内膜充血水肿及上皮细胞增生的病理评分均升高(P<0.05)；Tak-242低、中、高剂量组的上述病理评分均低于模型组，且高剂量组的上述病理评分均优于低、中剂量组(P<0.05)。见表3。

表2　各组大鼠的免疫细胞功能比较±s,n=15)

表3　各组大鼠的子宫病理改变评分比较±s,n=15)

3讨论

慢性盆腔炎是由盆腔炎症性疾病演变而来，由炎症因子相互作用和局部免疫共同调节，慢性盆腔炎患者的免疫系统遭到破坏，对致病微生物的抵抗减弱，易受厌氧菌和需氧菌的混合感染，导致了炎性细胞浸润，进一步影响盆腔及宫旁结缔组织〔6〕。目前抗生素是治疗该病的主要措施，但效果欠佳，长期使用会引发菌群紊乱，最终导致耐药的发生，故从根本上抑制炎症反应是该病的治疗重点〔7〕。TLR4通路在介导炎症反应中的关键作用已被证实，目前多种抑制TLR4通路的措施均获得较好的抗炎效果〔5,8〕，如TLR4抑制剂Tak-242对脑急性缺血再灌注损伤伴有的炎症反应有保护作用。Lin等〔8〕发现Tak-242可抑制脂多糖刺激诱发的滑膜成纤维细胞中 IL-1β和TNF-α 合成和释放。鉴于慢性盆腔炎是一种炎性反应，且抑制TLR4通路对于炎症反应有较好缓解效果，本研究推测TLR4抑制剂Tak-242对慢性盆腔炎可能有较好治疗效果。

参与机体免疫系统的炎症因子较多，主要包括辅助性T1细胞分泌的促炎因子和辅助性T2细胞分泌的抑炎因子，且两类因子的平衡对于维持正常免疫功能有重要意义，当两者失衡时可导致疾病的发生〔9〕。TNF-α、IL-6和IL-1β是促炎因子，在炎症初期有助于机体免疫的抗感染作用，但其持续升高会导致一系列病理生理改变，如诱导内皮细胞产生黏附分子、引起局部炎症反应及对子宫组织造成病理性损伤〔10〕。hs-CRP是参与炎症反应的急性时相蛋白之一，为评价炎症反应的灵敏指标〔11〕。本研究发现抑制TLR4可有效缓解慢性盆腔炎的炎症反应，与本研究之前的推测一致。

慢性盆腔炎患者的免疫力低下，导致了破坏性过度炎症反应，故理想的治疗措施不仅可缓解炎症反应，而且可提高机体的免疫功能〔12〕。本结果表明抑制TLR4可有效改善其免疫功能。子宫病理性改变是慢性盆腔炎的常见表现〔6〕，对子宫病理形态是否有改善作用也是评价治疗有效的重要指标。本研究进一步观察抑制TLR4对子宫病理形态的影响发现，给予Tak-242治疗后，粘连或扩张、上皮变性坏死、慢性炎症浸润、内膜充血水肿及上皮细胞增生的病理评分均获大幅改善，表明抑制TLR4通路对慢性盆腔炎治疗的有效性。

综上所述，Tak-242可抑制慢性盆腔炎大鼠的炎症反应，改善免疫功能及子宫病理改变。故抑制TLR4通路可能成为慢性盆腔炎治疗的新策略。

4参考文献

1赵永新,史志华.金刚藤不同剂型治疗慢性盆腔炎78例〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(7):1666-7.

2黄玲波,季银芬.慢性盆腔炎患者生活质量影响因素调查研究〔J〕.中国性科学,2013;22(6):15-17,21.

3贾连群,杨关林,任路,等.化瘀祛痰方药及其拆方对内皮细胞TLR4/NF-kB炎症信号通路干预的研究〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(23):5159-61.

4何晓乐,刘军,张航向,等.TLR4/NF-κB信号转导通路介导吡格列酮在内脂素诱导内皮细胞炎症损伤过程中作用机制的探讨〔J〕.中华老年多器官疾病杂志,2015;14(4):301-6.

5Hua F,Tang H,Wang J,etal.TAK-242,an antagonist for Toll-like receptor 4,protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2015;35(4):536-42.

6冯书梅,孙维峰.慢盆逐瘀汤对慢性盆腔炎大鼠血液流变学及病理组织形态学的影响〔J〕.广东医学,2011;32(1):25-8.

7李鑫,郭建生,师振予,等.妇科千金片对慢性盆腔炎大鼠血清炎性细胞因子表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2013;19(10):225-8.

8Lin X,Kong J,Wu Q,etal.Effect of TLR4/MyD88 signaling pathway on expression of IL-1β and TNF-α in synovial fibroblasts from temporomandibular joint exposed to lipopolysaccharide〔J〕.Mediators Inflamm,2015;2015:329405.

9陈云芬.川芎嗪对慢性盆腔炎患者的C-反应蛋白、TNF-α和IL-6的影响〔J〕.放射免疫学杂志,2013;26(1):127-8.

10张小玲,张诗军,徐成康,等.金丹盆乐汤灌肠联合熏蒸疗法对慢性盆腔炎患者血清 TNF-α和 IL-2水平的影响〔J〕.中国妇幼健康研究,2014;25(4):656-8.

11王玲玲,唐银辉,罗伶俐,等.急性心肌梗死介入术后无复流患者血清ADAMTS-13和hs-CRP水平的变化〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(3):610-2.

12杨林波,江伟华,巴东娇,等.柳叶蜡梅灌肠剂对慢性盆腔炎大鼠免疫功能和炎性因子的影响〔J〕.中国中医药科技,2012;19(4):346-7.

〔2015-07-19修回〕

(编辑徐杰)

〔中图分类号〕R711.33

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1053-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.013

第一作者：王春梅(1980-)，女，主治医师，主要从事盆底功能、妇科肿瘤研究。