白介素-17A对压力过负荷心衰小鼠的影响

安　君　李永财　刘旭光　安　康　高　健　吕君其　李　雄　杨海波

(宁夏人民医院　西北民族大学附属第一临床学院心胸外科，宁夏　银川　750021)



白介素-17A对压力过负荷心衰小鼠的影响

安君李永财刘旭光1安康2高健吕君其李雄杨海波

(宁夏人民医院西北民族大学附属第一临床学院心胸外科，宁夏银川750021)

〔摘要〕目的观察白介素(IL)-17A、基质金属蛋白酶(MMP)-2以及MMP-9在小鼠过负荷心衰形成中的影响。 方法选用C57BL/6 野生型小鼠为对照组，以IL-17A基因敲除小鼠(IL17A-/-)为实验组，经胸骨上窝利用部分夹闭主动脉弓心衰模型，测量心脏体重比(HW/BW)、心脏超声指标、MMP-2以及MMP-9 mRNA表达。结果C57BL/6野生型小鼠主动脉弓缩窄手术组(WT-AC组)10 w发生心衰，与C57BL/6野生型小鼠假手术组(WT-Sham组)比较，左室舒张末期直径(LVEDD)和左室收缩末期直径(LVESD)明显增大(P<0.01)、 左室后壁舒张末期厚度(LVPWD)和射血分数(EF)明显变小(P< 0.01)；rIL-17A无变化(P>0.05)，仅LVPWD变小(P< 0.01)；LVPWD和EF变小(P< 0.01)；WT-AC组HW/BW较WT-Sham组增大(P< 0.01)；IL-17A-/-主动脉弓缩窄手术组(IL-17A-/-AC组)与WT-Sham组比较增加(P< 0.01)；和IL-17A-/-假手术组(IL-17A-/-Sham组)比较亦增加(P< 0.05)；WT-AC组的MMP-2和MMP-9 mRNA表达较WT-Sham组增强(P< 0.01)；rIL-17A腹腔给予WT-Sham组比较其表达也增强(P< 0.01)；IL-17A-/-AC组与WT-Sham组比较，其mRNA表达增强(P< 0.01)；与WT-AC组比较，其表达明显下降(P< 0.01)。结论本研究提示IL-17A基因敲除后心衰过程减缓，MMP-2和MMP-9 mRNA表达增强提示IL-17A直接以及通过MMP-2和MMP-9表达参与过负荷心衰过程，IL-17A以及MMP-2和MMP-9通路是减轻、减缓心衰形成、发展的干预靶点之一。

〔关键词〕小鼠；心衰；模型；白介素17A； 基因敲除

心衰是高血压等多种心血管疾病所共有的终末期病理改变〔1〕。 至今压力过负荷所致心衰机制仍不清楚，是心血管领域亟待解决的热点。研究心衰的发生、发展及转归的基础是建立稳定、可靠心衰模型并在此基础上进行各种研究。本研究利用稳定、可靠的小鼠心衰模型，观察白介素(IL)-17A〔2〕对心衰形态功能以及对基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 mRNA表达的影响，初步探讨其可能的作用机制。

1材料和方法

1.1实验动物和分组实验动物: 选用8~10周龄、体重20~25 g的成年雄性小鼠。其中 IL-17A基因敲除雄性小鼠(IL-17a-/-)，由日本JUMRO公司石井铁男惠赠。C57BL/6野生型小鼠购自吉林白求恩医学院动物实验中心。动物的日常管理及实验研究依照美国国立卫生研究所颁布的《实验动物饲养和使用指南》和《吉林白求恩医学院实验动物管理办法》进行。鼠重组IL-17A(rIL-17A)购自美国R&D公司。

实验动物 40 只，随机分为5组：C57BL/6 野生型小鼠假手术组(WT-Sham 组,n=8)；C57BL/6 野生型小鼠主动脉弓缩窄手术组(WT-AC组,n=8)；C57/BL6 假手术+重组IL-17A腹腔注射组(WT + rIL-17A组,n=8)，该组动物于手术前 10 min注射 2.0 μg rIL-17，术后每周注射两次，每次2.0 μg rIL-17A〔3〕，直至5 w；IL-17A基因敲除小鼠假手术组(IL-17A-/-Sham 组，n=8)；IL-17A基因敲除小鼠主动脉弓缩窄手术组(IL-17A-/-AC组，n=8)。

1.2过负荷小鼠心衰模型制备戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)腹腔内麻醉，在小鼠胸骨上窝纵行切开约1~2 cm皮肤，显露右无名动脉和左颈总动脉间隙，用钽夹部分夹闭右无名动脉和左颈总动脉间的主动脉弓(缩窄后主动脉直径为0.35 mm)。假手术组，手术操作与模型制备组步骤完全相同，仅不用钽夹夹闭。

1.3心脏超声动态观察部分夹闭主动脉弓10 w后在相同麻醉下首先进行心脏超声观察，通过17 MHz探头(General Electric,Vivid V echocardiograph)观察左室舒张末期直径(LVEDD)、左室收缩末期直径(LVESD)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWD)以及射血分数(EF)。

1.4心/体重比(HW/BW)计算心脏超声观察完毕后将小鼠处死，分别称体重和心脏重量，获得心脏HW/BW之比(mg/g)

1.5RT-PCR MMP-2和MMP-9 mRNA表达小鼠心肌组织总RNA 提取：按Trizol 法提取说明书提取〔4〕。RNA 逆转录成cDNA：按RNase H-reverse transcriptase 试剂盒(Invitrogen,USA)说明书步骤进行。实时定量 PCR 检测：按 SYBR Green Master Mix(Takara,Japan)说明书试剂盒步骤进行。应用 ABI Prism 7900 数据分析系统(Applied Biosystems，USA)分析，用β-actin作为内参照标化。

小鼠MMP-2、MMP-9以及β-actin引物序列：基因名称MMP-2上游引物(5′-3′) ：CACACCAGGTGAAGGATGTG，下游引物(5′-3′)：GCCCTCCTAAGCCAGTCTCT；MMP-9上游引物(5′-3′)：CGTGTCTGGAGATTCGACTTGA，下游引物(5′-3′)；TGGAAGATGTCGTGTGAGTTCC；β-actin上游引物(5′-3′)：CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物(5′-3′)：TTTAATGTCACGCACGATTTC。β-actin(GenBank accession No EF095208)，330 bp，退火温度58.0℃，MMP-2(GenBank No.NM 004530)，162 bp，退火温度59.1℃；MMP-9(GenBank No.NM 004994)682 bp，退火温度62.7℃。

1.6统计学方法应用 SPSS19.0软件进行t检验。

2结果

2.1心脏超声动态观察WT-AC组10 w发生心衰，与WT-Sham组比较，LVEDD和LVESD明显增大，而LVPWD和EF明显变小(P<0.01)；WT+rIL-17A组与WT-Sham组比较，LVEDD、LVESD无变化，仅LVPWD和EF变小(P< 0.01)；与WT-AC组比较，IL-17A-/-AC组的LVEDD、LVESD明显变小，而LVPWD和EF明显增大(P<0.05)。见表1。

2.2各组HW/BW之比测定WT-AC组HW/BW〔(7.51 ± 0.48)mg/g〕较WT-Sham组〔(3.93 ± 0.46)mg/g〕增大(P< 0.05)；WT+rIL-17A组〔(4.30 ± 0.32)mg/g〕与WT-Sham组〔(3.93 ± 0.46)mg/g〕比较无变化(P>0.05)；IL-17A-/-Sham组与WT-Sham组比较无变化(P>0.05)；IL-17A-/-AC组(4.54 ± 0.35)与WT-Sham组(3.93 ± 0.46)和IL-17A-/-Sham组(3.73 ± 0.18)比较明显增加(P<0.01)。

表1　各组心脏超声指标测定

与WT-Sham组比较：1)P<0.01; 与WT-AC组比较：2)P<0.05; 与IL-17A-/-Sham组比较：3)P<0.05,4)P<0.01

2.3各组MMP-2和MMP-9 mRNA表达改变WT-AC组的MMP-2和MMP-9 mRNA表达较WT-Sham组明显增强(P<0.01)；WT+rIL-17A组与WT-Sham组比较其表达也明显增强(P<0.01)；IL-17A-/-AC组与WT-Sham比较，其mRNA表达显著增强(P<0.01)，见表2。

表2　各组MMP-2和MMP-9 mRNA表达改变

与WT-Sham组比较：1)P<0.01;与WT-AC组比较：2)P<0.01；与IL-17A-/-Sham组比较：3)P<0.01

3讨论

高血压等引起心脏后负荷增加最后导致心衰〔1〕,过负荷心衰以往大都用结扎部分主动脉方法，这种方法因结扎材料、打结方法等原因使其心衰模型形成时间和心衰程度不一而影响气候的研究结果。我们通过固定的钽夹直径控制夹闭程度建立心脏过负荷心衰模型，使其心衰模型形成时间、程度基本一致，从心衰模型制备上降低了实验误差。心衰主要的形态学改变是左室扩大、舒张功能障碍，进而导致全心衰竭〔1,5〕。Il-17A是由Th17细胞分泌的细胞因子〔2〕，通过自分泌/旁分泌诱导其他细胞因子，通过诱导MMP-2,MMP-9等因子参与心肌损伤、炎症、心肌纤维化和心脏重塑〔2,6〕。本研究结果说明过负荷是引起心衰的主因，IL-17A参与心衰过程，MMP-2和MMP-9也参与心衰过程。另外IL-17A直接参与过负荷引起的心衰过程，亦通过调控MMP-2和MMP-9 mRNA表达参与心衰。MMP-2和MMP-9 mRNA表达除了IL-17A外，受其他因子的调控，提示在过负荷心衰过程中除IL-17A外，其他因子通过调控MMP-2和MMP-9表达机制参与心衰。本研究提示在过负荷心衰中心脏超声中以LVPWD为最早变化(变薄)的指标，在心衰早期诊断上具有意义，而IL-17A基因敲除后心衰过程减缓、MMP-2和MMP-9 mRNA表达减弱，提示IL-17A直接以及通过MMP-2和MMP-9表达机制参与过负荷心衰过程，可能成为诊断早期心衰的指标，通过干预IL-17A以及MMP-2和MMP-9通路是减轻、减缓心衰形成发展的靶点之一。

4参考文献

1Weinberg EO,Schoen FJ,George D,etal.Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis〔J〕.Circulation，1994;90(3):1410-22.

2Wu L,Ong S,Talor MV,etal.Cardiac fibroblasts mediate IL-17A-driven inflammatory dilated cardiomyopathy〔J〕.J Exp Med,2014；211(7):1449-64.

3郭盛,张建华,吴良霞,等.重组白细胞介素-17A鼻黏膜免疫抗肺炎链球菌感染的实验研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,2012;32(3):258-63.

4刘旭光,安君,所剑,等.转化生长因子β1对巨噬细胞清道夫受体A和B(CD36)功能的影响〔J〕.吉林大学学报(医学版),2009;35(2): 284-7.

5Valente AJ,Yoshida T,Gardner JD,etal.Interleukin-17A stimulates cardiac fibroblast proliferation and migration via negative regulation of the dual-specificity phosphatase MKP-1/DUSP-1〔J〕.Cell Signal,2012;24(2):560-8.

6Kemp CD,Conte JV.The pathophysiology of heart failure〔J〕.Cardiovasc Pathol，2012;21(5):365-71.

〔2015-10-25修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

〔中图分类号〕R541.6

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1046-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.010

基金项目：吉林省科技发展计划资助项目(200705151, 20080730)

1吉林大学第一医院心脏外科

2上海交通大学医学院附属新华医院心胸外科

第一作者：安君(1963-)，男，教授，博士，博士生导师，主要从事心衰的机制研究。