三种膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇转运的影响

章海风　姜明霞　程　音　叶变良　翟成凯

(东南大学公共卫生学院，江苏　南京　210096)



三种膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇转运的影响

章海风1姜明霞程音1叶变良1翟成凯

(东南大学公共卫生学院，江苏南京210096)

〔摘要〕目的探讨分别来源于单一小麦、玉米和多种谷物与豆组合的膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇转运的影响。方法对人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞株进行体外培养，形成单层模型后，培养液中加入胆固醇胶囊和不同浓度的膳食纤维；MTT比色法检测细胞的生长情况，高效液相色谱法测定细胞液中的胆固醇含量。结果在100 μg/ml的膳食纤维干预浓度下，3种膳食纤维均显著减少了高胆固醇状态下Caco-2细胞单层模型的胆固醇转运(P<0.05)；至实验结束时，多种谷物与豆组合膳食纤维对胆固醇转运的抑制作用要好于单一小麦膳食纤维和玉米膳食纤维(P<0.05)。结论三种膳食纤维，尤其是多种谷物与豆组合膳食纤维对Caco-2细胞单层模型的胆固醇转运有一定的抑制作用。

〔关键词〕膳食纤维；Caco-2细胞；胆固醇

Caco-2细胞是来源于人类结肠和直肠的癌细胞〔1〕,是观察肠道对物质吸收、转运和代谢功能的经典体外模型之一〔2~5〕。作为动物实验的良好替代方法〔6〕,可用于检测受试物对肠道胆固醇吸收转运影响的研究〔7~9〕。已有的文献也表明〔10,11〕，膳食纤维(DF)可影响人体小肠对胆固醇的吸收，调节人体的脂代谢,但不同食物来源的膳食纤维具有不同的功能作用。本文旨在探讨来自小麦、玉米和多种谷物与豆组合的不同来源膳食纤维对Caco-2细胞单层模型胆固醇转运的影响。

1材料与方法

1.1细胞与材料Caco-2细胞株由江苏省中医药研究院提供(美国休斯顿大学胡明教授馈赠)；膳食纤维由本实验室采用酶-化学法分别提取；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自美国Equitech-Bio公司；胆固醇、大豆卵磷脂、牛磺胆酸钠、胆固醇试剂盒购自美国Sigma公司；依折麦布片剂(Ezetimibe)是批准用于临床的选择性胆固醇吸收抑制剂，购自新加坡Schering-Plough公司。

1.2Caco-2细胞的培养将复苏后的Caco-2细胞以2×105/ml密度接种于25 cm2的细胞培养瓶中，加入5 ml含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 U/L青霉素-链霉素双抗的不完全DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。定时更换细胞培养液，待细胞生长至80%~90%时用胰酶消化、传代，选取对数生长期的细胞用于转运实验研究。

1.3Caco-2细胞电阻值的测定先将Millicell-ERS型细胞电阻仪的电极在70%乙醇中浸泡15 min，空气中干燥15 min，然后放入与培养液相似的无菌电解质中浸泡15 min。Caco-2单细胞层用HBSS冲洗细胞3次，将电极分别放置于TransWellTM培养板中A侧小室与B侧小室测定电阻值，并计算跨膜电阻〔12〕。直径为2.4 cm的6孔板，电阻值的计算公式为：TEER=1.2×1.2×3.14×(Ω1-Ω2)(Ω1为干预前测量电阻，Ω2为空白电阻)。

1.4实验分组阴性对照组(CL)：正常培养，不加干预物；胆固醇模型组(CH)：胆固醇胶囊培养基；阳性对照组(E)：胆固醇胶囊+10 μmol/L依折麦布；小麦DF(W)：胆固醇胶囊+小麦DF；玉米DF(C)：胆固醇胶囊+玉米DF；多种谷物与豆组合DF(CSC)：胆固醇胶囊+多种谷物与豆组合DF。

1.5胆固醇胶囊溶液的配制胆固醇胶囊作为胆固醇培养液中的胆固醇源，采用溶剂诱导法进行配制，具体参照文献〔13〕。实验前配制，称取卵磷脂(0.6 mmol/L)溶于甲醇溶液，超声后N2干燥；再加入牛磺胆酸钠(2 mmol/L)和胆固醇(1 mmol/L)，加入乙醇超声溶解，N2干燥；最后溶解在pH 7.4的HBSS溶液中,0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，储存备用。

1.63种膳食纤维影响Caco-2细胞存活率的MTT试验分别将膳食纤维按照不同浓度(50、100、200、400 μg/ml)置于pH7.4培养基中，超声溶解并通过0.45 μm的滤过膜，37℃保存备用。

将Caco-2细胞以每孔2 000个的浓度接种到96孔板，每孔体积200 μl，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h，然后加入不同浓度的膳食纤维培养基孵育24 h。对照组为Caco-2细胞在完全培养基中孵育24 h，用HBSS溶液洗涤3次后，弃去上清液，加入20 μl MTT溶液，无血清培养基180 μl，37℃继续孵育4 h后终止培养，小心弃去上清液，然后加入200 μl DMSO，轻轻吹打混匀，转移200 μl至新的96孔板中，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫荧光仪波长490 nm处测OD值，记录结果。

取5孔OD值得均数，按下公式算出细胞存活率(IC)：细胞存活率(IC)= 〔实验孔OD均值/对照孔OD均值〕×100%。

98%的细胞存活所对应的膳食纤维浓度(IC98)作为干预的敏感剂量，转运实验选择应低于此剂量。

1.73种膳食纤维抑制Caco-2细胞胆固醇转运的试验方法将小麦DF、玉米DF和多种谷物与豆组合DF分别配制成一定的浓度，溶解在HBSS胆固醇胶囊溶液中，其中阳性对照组为10 μmol/L依折麦布溶液，超声溶解并通过0.45 μm的滤过膜，37℃保存备用。

选取符合转运条件且细胞生长形态完好的TransWellTM膜，移至到有1.5 ml HBSS的新的6孔板，往A侧轻柔加入0.5 ml HBSS，于37℃轻柔振动15 min后，HBSS清洗3遍，并检测每孔细胞TEER值3次，取平均值。移出上下两小室的HBSS缓冲液，尽量吸干净残余的液体，然后添加0.4 ml含有膳食纤维的供液于A侧支持膜上，添加1.2 ml HBSS溶液于B侧，分别在不同时间(0 min、30 min、60 min、90 min及120 min)吸取0.4 ml接收液，同时补加0.4 ml空白接收液。利用高效液相色谱法测定胆固醇的含量，最后一次取样后计算质量平衡。

1.8胆固醇含量的检测本文采用高效液相色谱(HPLC)法〔14,15〕测定Caco-2细胞渗透液中的胆固醇的含量。色谱条件：色谱柱Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm,2.1 mm×50 mm)。流动相：甲醇(100%)。流速为0.3 ml/min，检测波长为205 nm，柱温为38℃，进样量为10 μl。

在已选定的高效液相色谱条件下，将配好的标准溶液系列进行测试，以胆固醇浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。分别配制不同浓度的胆固醇标准溶液，浓度分别为2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/ml,通过HPLC测定其峰面积，根据胆固醇浓度与峰面积的关系，回归直线方程为Y=128.4+904.4X，相关系数r=0.999。

1.9数据处理与统计分析采用SPSS15.0软件进行one-way ANOVA检验、SNK检验。

2结果

2.1Caco-2细胞单层模型的电阻值本次细胞生长状态良好，转运前细胞TEER值平均保持在482~595 Ω/cm2左右(CL：534.3±27.0，CH：508.7±51.5，E：507.9±30.5，W：571.2±77.7，C：580.3±50.6，CSC：517.7±42.6)，每孔之间也未见统计学差异(P>0.05)，说明Caco-2细胞在TransWellTM板中培养21 d后已经形成了完整的单层细胞模型，可以用于物质的转运实验〔16〕。

2.23种膳食纤维对Caco-2细胞存活率的影响Caco-2细胞对3种膳食纤维的敏感剂量各不一样。由表1可见，小麦DF和多种谷物与豆组合DF，随着浓度由50 μg/ml增加到400 μg/ml，其细胞的存活率(IC)均呈增加趋势；玉米膳食纤维浓度在100 μg/ml时，其细胞的存活率(IC)最高，表明谷物膳食纤维在一定浓度范围内对Caco-2细胞的存活具有一定的促进作用。本次试验选择膳食纤维干预的转运浓度为100 μg/ml。

2.33种膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇转运的影响从图1可以看出，在100 μg/ml的DF干预浓度下，随着时间延长，每种细胞液中的胆固醇浓度均呈上升趋势。胆固醇模型组上升趋势最明显，30~120 min时，胆固醇模型组细胞液中的胆固醇浓度显著高于其余各组(P<0.05)。阳性对照组抑制胆固醇转运的影响最为明显，在30 min时，依折麦布完全抑制了胆固醇的转运，30 min后才开始检测出转运的胆固醇，至实验结束，阳性对照组的胆固醇转运浓度缓慢上升，胆固醇浓度显著低于胆固醇模型组和膳食纤维干预组。与胆固醇模型组相比，膳食纤维组胆固醇浓度显著降低(P<0.05)。比较3种谷物DF，30 min时多种谷物与豆组合DF组和小麦DF组，抑制胆固醇转运的作用好于玉米DF组，而多种谷物与豆组合DF和小麦DF对Caco-2细胞胆固醇转运具有相似的抑制性。至120 min实验结束时，3种膳食纤维之间未见明显差异(P>0.05)。在试验过程中，阴性对照组细胞液中始终未检测出胆固醇，在图1中不再显示。

表1　不同浓度膳食纤维对Caco-2细胞存活率的影响(%)

图1　3种膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇转运的影响

3讨论

Caco-2细胞是来源于人类结肠和直肠癌的细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，成为一个比较理想的体外小肠吸收模型，常常被用来检测一些口服药物和外源性物质的吸收效果。经过21 d左右的培养，形成单层模型，在肠腔侧分化出绒毛面AP侧(肠腔侧)和基底面BL侧(肠内壁侧)。AP侧含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质的转运载体，可发挥主动转运物质的作用，如糖类、氨基酸、胆酸及维生素B内源性因子的主动转运载体在Caco-2细胞都有表达；存在于小肠细胞刷状缘的酶，如氨肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶等也同样存在于细胞中。研究物质从小肠的浆膜层到黏膜侧和从黏膜侧到黏膜层吸收特性，可以清晰地表达药物的转运与排泄方式〔17〕。利用细胞电阻仪测定跨上皮细胞的电阻，是一个常用的、有效的方法，可反映出经过21 d培养后的Caco-2单层细胞紧密性和完整性，决定培养后的Caco-2细胞能否进行进一步的转运实验。本实验在细胞培养过程中，发现Caco-2细胞生长7 d后达到融合，10 d后细胞开始均匀致密，在光学显微镜下可清晰看见呈多角形扁平状的单个细胞体，多细胞间紧密连接，细胞生长状态良好，与文献报道相一致〔18〕。Caco-2细胞在TransWellTM板中培养21 d后已经形成了完整的单层细胞模型，可以用于本文胆固醇的转运实验。

目前，已有较多关于利用Caco-2细胞单层模型来观察药物或外源性物质对人体小肠胆固醇吸收和转运影响的实验研究。冯丹等〔19〕实验结果显示，25～100 μmol/L姜黄素可有效降低Caco-2细胞NPC1L1的基因和蛋白表达，显著抑制细胞胆固醇的吸收。赵战芝等〔20〕利用Caco-2细胞模型来研究大蒜素对肠道胆固醇外排及胆固醇转运基因ABCG5/ABCG8表达的影响，结果表明，与对照组比较，胆固醇微胶粒可增加Caco-2细胞内脂滴和胆固醇含量，而大蒜素可减少胆固醇微胶粒处理后Caco-2细胞内脂滴和胆固醇含量，增加细胞内胆固醇排出率，并可显著上调Caco-2细胞ABCG5和ABCG8的蛋白水平。因此，在借鉴文献研究的基础上，笔者通过建立Caco-2细胞模型，研究小麦、玉米和多种谷物与豆组合3种膳食纤维对胆固醇吸收转运的影响。同时，考虑到膳食纤维是一种难溶性的物质，而且理论上也无法透过细胞膜进入细胞，因此，本实验主要研究了膳食纤维对胆固醇从AP侧到BL侧转运的影响。本章实验结果也显示，胆固醇模型组Caco-2细胞中，胆固醇的转运量显著增加，而3种膳食纤维和阳性对照物可明显抑制高胆固醇状态下Caco-2细胞中胆固醇的转运。依折麦布是一种用于临床的选择性胆固醇吸收抑制剂，可作用于小肠细胞的刷状缘，以甾醇载体(NPC1L1)为分子靶点〔21〕，选择性地抑制肠道对食物中TC以及胆汁中TC的吸收，从而使胆固醇由肠道向肝脏运输相应减少〔22〕。膳食纤维对Caco-2细胞单层模型胆固醇转运的抑制作用，可能是调节了Caco-2细胞单层模型中NPC1L1的表达，从而抑制了胆固醇的转运；其次，已有的研究表明，膳食纤维具有一定的持水性、膨胀性、黏稠性和吸附性等理化特性，因此，吸水溶胀的胆固醇，增加了细胞液的黏稠性，阻碍了胆固醇的转运。膳食纤维对胆固醇的物理性吸附，也降低了胆固醇的浓度，从而降低了胆固醇的转运。

本实验结果还表明，至实验结束时，3种膳食纤维对胆固醇转运表现出了不同的抑制效果。多种谷物与豆组合膳食纤维对Caco-2细胞中胆固醇转运的抑制作用好于小麦DF和玉米DF组，但三者之间未见明显的统计学差异，还需要作进一步的深入研究。不同食物来源的膳食纤维对人体健康的保健作用有所不同，这与其自身结构、理化特性和来源具有一定的关联。根据本课题组之前的研究表明，多种谷物与豆组合DF比单一的小麦DF和玉米DF ,具有更强的持水性、膨胀性和胆固醇吸附能力等，这可能是多种谷物与豆组合DF对胆固醇的抑制作用好于单一小麦DF和玉米DF的原因之一。

综上，膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇的转运吸收有一定的抑制作用。其作用机制可能是物理性地阻碍了胆固醇物质的转运，也可能是通过抑制胆固醇转运蛋白NPC1L1表达，降低肠细胞对胆固醇的吸收转运。膳食纤维对Caco-2细胞胆固醇转运的影响可能是多渠道的，其具体机制有待进一步研究。

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〔2015-11-20修回〕

(编辑曲莉)

Effects of three kinds of dietary fiber on cholesterol transport in Caco-2 cells

ZHANG Hai-Feng, JIANG Ming-Xia, CHENG Yin,etal.

School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210096,Jiangsu, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the dietary fiber (DF) from wheat (W), corn (C), and cereal-soybean combination(CSC) on cholesterol transport in Caco-2 cells.MethodsThe human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 was cultured in vitro. After the monolayer model was formed, cholesterol micelles and different concentrations of dietary fiber were added into the culture medium. The growth of cells was detected by MTT colorimetry. The cholesterol content in the cell was determined by HPLC.ResultsIn the intervene of 100 mg/ml DF concentration, three kinds of DF were significantly reduced cholesterol transport in Caco-2 cell monolayer model under the high cholesterol concentration(P<0.05). To the end of the experiment, the inhibition effect of the CSC dietary fiber on cholesterol transport was better than that of wheat DF and corn DF(P<0.05).ConclusionsThree kinds of DF, especially DF of cereal-soybean combination, could inhibit cholesterol transport in Caco-2 cell monolayer model.

【Key words】Dietary fiber; Caco-2 cell; Cholesterol

〔中图分类号〕R39

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1032-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.004

通讯作者：翟成凯(1947-)，男，教授，主要从事营养与健康研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(81372986；30471451)

1扬州大学旅游烹饪学院

第一作者：章海风(1977-)，男，讲师，在读博士，主要从事膳食营养与健康研究。