米氏硫胺素芽孢杆菌的分离及鉴定

张 晶，徐宏伟，曾国航，宋显明，艾东旭， 李莲瑞

(1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔 843300；2. 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3. 塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

米氏硫胺素芽孢杆菌的分离及鉴定

张 晶1，徐宏伟1，曾国航1，宋显明1，艾东旭1， 李莲瑞2,3

(1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔 843300；2. 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3. 塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

【目的】分离、纯化土壤中的细菌，通过鉴定得到米氏硫胺素芽孢杆菌。【方法】通过生化鉴定、提取细菌基因组并进行细菌16 s rDNA测序等方法鉴定。【结果】此细菌生化鉴定结果符合《常见细菌鉴定手册》中的关于米氏硫胺素芽孢杆菌的生化鉴定，将细菌的16 s rDNA测序结果在NCBI上进行比对,表明该细菌为米氏硫胺素芽孢杆菌。【结论】分离、纯化得到的细菌经测序对比后确定是米氏硫胺素芽孢杆菌。

细菌分离；细菌鉴定； 16 s rDNA；米氏硫胺素芽孢杆菌

0 引 言

【研究意义】米氏硫胺素芽孢杆菌属于硫胺素芽孢杆菌属，革兰氏阳性杆状细胞，细胞宽度为0.5～1.0 μm，芽孢椭圆形，芽孢中生、近中生和亚端生，包囊稍膨大。能够在常规培养基中生长，例如营养琼脂和酪朊大豆琼脂[1]。该菌在1996年由Shida等分离并命名[2]。Hiroaki Takagi等[3]基于表型特征和分子杂交，将其35株Bacillusbrevis(短芽孢杆菌)菌种分为六个独立的种群，这其中就包括Aneurinibacillusmigulanus。该菌能够分解硫胺素[4]，在国内的研究甚少，对该株细菌的进一步的鉴定非常有必要。rRNA是核糖体的重要组成部分，也是RNA中含量最多的，达到80%以上。原核生物的核糖体RNA按照沉降系数分为三类，5、16和23 s。5 s rRNA的编码基因(rDNA)最小150 bp左右，包含的遗传信息有限，23 s rRNA的编码基因(rDNA)为3 kb左右，太大，而16 s rRNA的编码基因16 s rDNA的大小为1 500 bp左右，大小适中，且其包含了丰富的遗传信息。16 s rDNA包含10个可变区和一个稳定区，其中可变区具有种间特异性，恒定区则差异很小，故可以利用16s rDNA的这个特点来对微生物进行鉴定分类，一般不同菌属16 s rDNA的序列一致性在70%～95%，大于95%便可以确定为同一个菌属[5-6]。与此同时，大量微生物尤其是致病微生物的16 s rDNA的序列已经被克隆，测序并被数据库收录，为利用16 s rDNA法鉴定微生物奠定了坚实的物质基础。【前人研究进展】Marina Berditsch[7]等AneurinibacillusmigulanusATCC9999菌株的菌落形态和产短杆菌肽能力的研究中，对AneurinibacillusmigulanusATCC9999的六种菌落形态做了具体描述，并对每种菌落形态下产抗菌素短杆菌肽的能力进行了比较。同时证明Aneurinibacillusmigulanus能产生抗菌的短杆菌肽S，短杆菌肽S是10个氨基酸组成的环状多肽，其氨基酸组成为[FPVOLFPVOL]cyclo，短杆菌肽S具有很广谱的抗菌活性，包括革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌，病毒和单真核细胞[8]。丁若垚等[9]利用米氏硫胺素芽孢杆菌DY3菌株沤麻制备红麻纤维。陈艳玲[10]在EM菌中分离鉴定到一株硫胺素芽孢杆菌，该菌不仅能分解含硫物质、含氮物质，还能分解无机磷和有机磷，有效地增加土壤活性磷的含量，从而供植物吸收利用[11]；在陈艳玲的单一菌种发酵实验中，硫胺素芽孢杆菌还有显著地分解动物蛋白的效果，适合水产品加工下脚料的发酵。利用16 s rDNA来鉴定微生物尤其是致病微生物的应用是很多的，黄劲等[12]利用PCR扩增16 s rRNA的保守区域成功鉴定出甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株；常洪涛等[13]通过16 s rRNA对河南淮南猪源副猪嗜血杆菌进行鉴定；该法快速，准确，已经被广泛应用到微生物的鉴定中。Hua Zhou等[14]通过16 s rDNA序列分析鉴定普雷沃菌。【本研究切入点】对该菌进行生化鉴定，根据东秀珠、蔡妙英等的《常见细菌系统鉴定手册》初步判定细菌种属，利用16 s rDNA鉴定该菌，通过数据库比对最终确定其种属。【拟解决的关键问题】通过米氏硫胺素芽孢杆菌的分离与鉴定、扩增细菌16 s rDNA并送测序以确定菌种。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种来源

新疆塔里木大学校园某试验站楼旁距地表20～80 cm土样。

1.1.2 主要仪器、药品

BCD-223GB型冰箱(科龙电器)；HH-2型数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；CX31型生物显微镜(日本欧林巴斯光学株式会社)；SW-CJ-KU型超净工作台(上海博讯实业有限公司)；DW-HW 328型-80℃冰箱(中科美菱低温科技有限公司)；AUW220 SHIMADIU电子天平(日本岛津电子天平)；Neofuge 15 R型超速冷冻离心机(Heal Force Development Ltd.力康发展有限公司)； ZHWY—200D全温度振幅高速轨道摇床(上海智城)；Bio-metra的PCR仪；bio-rad凝胶成像系统；水浴锅；紫外分光光度仪。

氢氧化钠、0.4%酚红溶液、氯化钠(分析纯)、葡萄糖、琼脂、磷酸氢二钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、明胶、溴百里香酚蓝、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、碘化钾、甲基α-萘胺，5 mol/L 冰醋酸，对氨基苯磺酸，冰醋酸、对二甲基氨基苯甲醛，无水乙醇，浓盐酸、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢铵、柠檬酸钠、0.1% L-酪氨酸、液体石蜡、卢哥氏碘液、格里斯亚硝酸盐试剂、Ehrlish试剂、尿素、醋酸、硫酸铵二甲苯、10%氯化铁、氯化钙、酵母膏、可溶性淀粉、过氧化氢均为国产；牛肉膏、牛肉浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸新霉素、多粘菌素、卡那霉素(生化试剂)、酵母粉均购自sigma；基因组提取试剂盒购自天根；凝胶回收试剂盒购自全式金；PMD-18T购自takara公司；PCR所用到的试剂。

1.1.3 试剂及配置(1)1 mol/L氢氧化钠标准溶液

用电子天平称取氢氧化钠40.0 g溶于1 L蒸馏水中，待其冷却至室温后用1 mol/L盐酸标准液进行滴定检验其浓度是否为1 mol/L。检验后置于常温下备用。

(2)0.4%酚红溶液

称取0.4 g酚红置研钵中研碎，逐渐加入0.l mol/L 氢氧化钠溶液1.28 mL,边加边研磨，使酚红转变成钠盐而溶于水中直到所有的颗粒完全溶解，然后倒入容量瓶中，定容至100 mL,滤纸过滤后棕色瓶4 ℃保存备用。

(3)生理盐水

用电子天平称取0.9 g氯化钠溶于100 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20 min后常温保存备用。

(4)1%葡萄糖分离培养基

用电子天平分别称取5.0 g氯化钠、5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、10.0 g葡萄糖、20.0 g琼脂置于1 L的烧杯内加700 mL蒸馏水加热使上述试剂溶解。将溶解后的溶液冷却至室温后用1 mol/L的氢氧化钠标准液调pH 7.4～7.6后用蒸馏水定容到1 L，分装。用121℃高压灭菌20 min后放入4℃冰箱内备用。

(5)1%葡萄糖增菌液

用电子天平分别称取5.0 g氯化钠、5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、10.0 g葡萄糖置于1 L的烧杯内加700 mL蒸馏水加热使上述试剂溶解。将溶解后的溶液冷却至室温后用1 mol/L的氢氧化钠标准液调pH 7.4～7.6后用蒸馏水定容到1 L分装。用121℃高压灭菌20 min后放入4℃冰箱内备用。

(6)50%卵黄盐水

取鲜鸡蛋一个，用医用酒精对蛋壳表面进行消毒。在无菌工作台中将卵黄与卵蛋白分离开来，用无菌医用注射器吸出卵黄内物质按1∶1的比例溶于无菌的生理盐水备用。

(7)EYA(卵黄琼脂)培养基

用电子天平分别称取40.0 g胰蛋白胨、2.0 g葡萄糖、5.0 g磷酸氢二钠、20.0 g琼脂、2.0 g氯化钠、5.0 g硫酸镁置于1 L的烧杯内加700 mL蒸馏水加热使上述试剂溶解。将溶解后的溶液冷却至室温后用1 mol/L的氢氧化钠标准液调pH 7.4～7.6后用蒸馏水定容到1 L分装。用121 ℃高压灭菌20 min后放入恒温水浴锅内，向内加入50 %卵黄盐水100 mL混匀后倒到平板上，倒好的平板于4 ℃保存备用。

(8)尿素鉴定培养基

用电子天平分别称取0.50 g蛋白胨、0.05 g葡萄糖、0.25 g氯化钠、0.10 g磷酸二氢钾置于100 mL的烧杯内加30 mL蒸馏水加热使试剂溶解，再加入0.4 %酚红0.15 mL混匀。将溶解混匀后的溶液冷却至室温后用1 mol/L的氢氧化钠标准液调pH 7.2～7.4后用蒸馏水定容到50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。放入55 ℃恒温水浴锅内，保温30 min后，将20 %尿素溶液在无菌条件下用滤器过滤注入上述溶液混匀，每只试管分装10 mL后制成斜面。

(9)明胶鉴定培养基

用电子天平称取0.25 g蛋白胨、6.00 g明胶、0.15 g牛肉膏置于100 mL的烧杯内加30 mL蒸馏水加热使试剂溶解。将溶解混匀后的溶液冷却至室温后用1 mol/L的氢氧化钠标准液调pH 7.2～7.4后用蒸馏水定容到50 mL，121℃高压灭菌20 min。放入55 ℃恒温水浴锅内保温30 min后在无菌条件下用滤器过滤注入上述溶液混匀，每只试管分装10 mL后制斜面。

(10)糖鉴别培养基

用电子天平称取3.4 g蛋白胨、1.5 g氯化钠、0.03 g溴百里香酚蓝至于500 mL的烧杯中加200 mL蒸馏水加热溶解试剂。将溶解混匀后的溶液冷却至室温后用1 mol/L的氢氧化钠标准液调pH 7.2～7.4后用蒸馏水定容至300 mL，在无菌条件下每只试管分别加入10 mL并向每种糖发酵管中加入相应的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇各0.25 g。121℃高压灭菌20 min制斜面，于4℃保存备用。

(11)卢哥氏碘液

先在三角瓶中加入少量(10 mL)蒸馏水，加入10 g碘化钾并用搅拌棒使之溶解。再加入5 g碘并搅拌一段时间使之完全溶解(不易溶解)，加蒸馏水定容至100 mL，装试剂瓶常温下保存备用。

(12)格里斯亚硝酸盐试剂

甲液：甲基α-萘胺0.6 g，5 mol/L 冰醋酸100 mL，加热溶解，4～10 ℃保存。

乙液：对氨基苯磺酸0.8 g，5 mol/L 冰醋酸100 mL，先用30 mL冰醋酸溶解对氨基苯磺酸，再加入冰醋酸至100 mL，4～10 ℃保存。

(13)Ehrlish试剂

对二甲基氨基苯甲醛1 g，无水乙醇95 mL，浓盐酸20 mL混匀、溶解。

(14)硝酸盐培养基

将1 g蛋白胨、0.1 g硝酸钾、蒸馏水100 mL加入三角瓶中加热、溶解，将溶解混匀后的溶液冷却至室温，用1 mol/L 的氢氧化钠标准液调pH=7.4，并用蒸馏水定容到100 mL，121 ℃高压灭菌15～20 min后，分装试管，置于4 ℃保存备用。

(15)柠檬酸盐利用

用电子天平称0.1 g氯化钠、0.02 g七水硫酸镁、0.05 g磷酸二氢铵、0.2 g柠檬酸钠、琼脂2 g，量筒量取蒸馏水100 mL、0.04% 酚红2 mL。以上成分除指示剂外其余加热溶解，调节pH 6.8～7.0，并加入指示剂，使培养基呈枚红色，121 ℃高压灭菌20 min后，倒平板，凝固后置于4 ℃保存备用。

(16)淀粉水解

在三角瓶中加入0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g氯化钠、0.2 g可溶性淀粉、蒸馏水100 mL，加热溶解，调节pH 7.0～7.2，然后加入2 g琼脂，定容至100 mL ，121 ℃高压灭菌20 min后，倒平板，凝固后置于4 ℃保存备用。

(17)吲哚培养基

在三角瓶中加入1 g蛋白胨、0.5 g氯化钠溶解，调pH=7.6，蒸馏水定容至100 mL，分装1/3-1/4试管，121 ℃ 高压灭菌20 min。Ehrlish试剂待使用。

(18)酪氨酸水解培养基

采用肉汤蛋白胨培养基加0.1% L-酪氨酸，调节pH=7.0，121℃ 高压灭菌20 min，倾倒平板。

1.2 方 法

1.2.1 细菌分离

采样：取新疆塔里木大学校园某试验站楼旁距地表20～80 cm土样1 g。

富集培养：将1 g样品于l mol/L明胶磷酸盐缓冲液中，机械法均质后，于75～80 ℃的水浴保温15 min。以3 000 r/min离心5 min,然后加入50%乙醇1 mL，用涡旋混匀器将其混匀后作用20 min。再用3 000 /min离心5 min，去掉上液，用pH 7.0的磷酸缓冲液冲洗，反复作用3次。

分离培养：从富集增菌液中取出100 μL于1.5 mL的离心管中，加入900 μL的1%葡萄糖疱肉液体培养基做倍比稀释。稀释倍数为10、102、103、104倍，分别涂于1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上，37℃条件下培养24 h。将倍比稀释涂板长出的单菌落用接种环刮下，用1%葡萄糖疱肉液体培养基稀释后涂于含有10 g/mL硫酸新霉素平板上，37℃条件下培养24 h。将能够在含有10 g/mL硫酸新霉素1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上生长的菌落用接种环刮下，用1%葡萄糖疱肉液体培养基稀释后涂于含有10 g/mL卡那霉素1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上， 37℃条件下培养24 h。将能够在含有10 g/mL卡那霉素平板上生长的菌落用接种环刮下，用1%葡萄糖疱肉液体培养基稀释后涂于含有100 000 g/mL多粘菌素1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上，37℃条件下培养24 h。将能够在含有100 000 g/mL多粘菌素1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上生长的菌落用接种环刮下，用1%葡萄糖疱肉液体培养基稀释后涂于含有10 g/mL硫酸新霉素、卡那霉素和100 000 g/mL多粘菌素1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上，37℃条件下培养24 h。将能够在10 μg/mL硫酸新霉素、卡那霉素和100 000 μg/mL多粘菌素1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上生长的菌落接种于EYA培养基上(卵黄琼脂培养基)，37℃条件培养24 h，观察生长情况。挑取单菌落进行液体增菌培养。

制样品稀释液：取装有无菌水900 μL的试管4支，编号10-1、10-2、10-3、10-4，进行梯度稀释。再从增菌液中吸取100 μL菌液加入到编号10-1的试管中，混匀，制成1∶10浓度的悬液，移取100 μL 10-1管中液体于10-2管中混匀，然后移取100 μL 10-2管中土壤悬液于10-3管中混匀，直至稀释到10-4管。

细菌保存：挑取最终分离得到的单菌落接种在含有3 mL普通液体培养基的试管中，置于ZHWY-200D全温度振幅高速轨道摇床37℃、180 r/min培养6 h，试管中的液体培养基变浑浊。在菌种管中，加入500 μL的浑浊菌液，然后加入500 μL的甘油，涡旋振荡30～60 s，封膜保存于-20℃备用。

1.2.2 细菌的生化鉴定

地衣芽胞杆菌鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册》[7]及《常见细菌系统鉴定手册》[6]的方法，对分离的细菌进行鉴定。

(1)菌体形态观察

革兰氏染色：用接种环从新鲜培养的菌落上挑取一环菌，对菌体进行革兰氏染色。染色后，在油镜下镜检。若菌体呈蓝紫色，则为革兰氏阳性细菌；若菌体呈红色，则为革兰氏阴性细菌。

孔雀石绿染色：对芽孢进行染色，染色后镜检，芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

(2) 菌落培养特征

在鉴别培养基—卵黄琼脂培养基(EYA)上进行培养，观察并记录菌落的形状、大小、突起、边缘、粘稠性、颜色、光学特性及气味等特征。

(3)糖(醇)代谢试验

采用细菌生化微量鉴定管进行糖(醇)或糖昔发酵试验。选择葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、七叶昔这六种糖(醇)或糖苷发酵培养基用于该试验。将待检菌的新鲜纯培养物，用接种环(或针)接种至被选用的糖发酵培养基中，置适宜温度培养数小时至几天(一般阳性24～48 h出现阳性反应，如为阴性时，继续观察3～4 d仍不出现反应)。待检菌发酵所试验的糖(醇)或糖昔时，管内的pH指示剂变色，阳性反应记为“+”，阴性反应记为“-”。

(4) 尿素酶试验

浓密地涂布待检菌新鲜纯培养物在尿素琼脂斜面培养基上，置37 ℃培养，于2～4及24 h各观察一次结果。培养基呈现红色时为阳性反应，颜色不变色为阴性反应，如为阴性可继续培养观察4 d。

(5)明胶液化试验

取待检菌纯培养物，穿刺接种于明胶培养基管中，于37 ℃培养7 d，每天观察结果。判定结果前，放冰箱10～20 min。如明胶呈现液体状态为阳性反应，呈凝固状态为阴性反应。

(6) 硝酸盐还原试验

待检菌的新鲜纯培养物接种于硝酸盐培养基中，37 ℃培养3～4 d。取试剂甲液与乙液，等量混合后加入培养液中，每5 mL培养液加入混合试剂0.1 mL后观察结果，显红色为阳性反应。

(7)柠檬酸盐利用

无菌条件下将幼龄菌种涂布接种于柠檬酸盐培养基上，37 ℃恒温培养3～7 d，观察培养基颜色变化。

(8) 淀粉水解

用接种环取少量的菌种涂布于培养基表面，37 ℃恒温培养24～48 h，取出后滴加少量的卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，观察菌落周围变化。

(9)卵黄卵磷脂酶试验

接种环取少量培养18～24 h的幼龄菌种涂布于卵黄卵磷脂酶平板上，37 ℃恒温培养24～48 h，观察菌落四周是否有不透明的区。

(10) 形成吲哚

将菌种接种于蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养24 h后，取出后加入二甲苯2～3 mL，摇匀静置，沿试管壁缓慢加入Ehrlish试剂2 mL，静置，观察颜色变化。

(11)酪氨酸水解试验

用接种环挑取单菌落涂布于培养基上，培养7～14 d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。

(12)接触酶

将培养24 h的斜面菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。

1.2.3 细菌16 s rDNA的鉴定

1.2.3.1 总DNA的提取

米氏硫胺素芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，要借助溶菌酶的作用才能很好地破坏该菌的细胞壁，所以在提取基因组之前，先用20 mg/mL的溶菌酶37°C处理40 min，之后利用天根公司提供的DNA提取试剂盒，并按照试剂盒说明书，提取米氏硫胺素芽孢杆菌的DNA。

1.2.3.2 16 s rDNA基因扩增

选择的引物为扩增细菌的通用引物PF：5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3’和PR：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，扩增目的片段长度为1 500 bp左右，PCR扩增体系选用20 μL体系：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，PF 0.5 μL，PR 0.5 μL，模板 2 μL，TaqDNA聚合酶 0.4 μL，ddH2O 13 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性55 s，57℃退火55 s，72℃延伸55 s，共进行30个循环，结束循环后72℃再延伸10 min。

1.2.3.3 T载体的连接和转化

切胶回收目的片段，检测目的片段的浓度，将载体和目的片段按摩尔比为1∶3的比例混匀，加入solution I，16℃连接过夜，连好之后，将其加入100 L DH5α中，热击90 s，37℃活化1 h，接种于含100 g/mL氨苄抗生素的LB板上，倒置培养12～16 h。

1.2.3.4 挑取已鉴定的阳性克隆送往北京金诺锐杰有限公司测序，并用NCBI/BLAST工具对序列进行比，确定其具体的菌属。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离与形态分析

对增菌液分别用10倍、102倍、103倍、104倍稀释处理涂布于1%葡萄糖疱肉固体培养基平板上。研究表明，随着稀释倍数的增大平板上生长的菌落数减少，逐渐出现单菌落。图1

图1 增菌液做不同倍数稀释处理得到的菌落

Fig.1 The different concentration of disposed enrichment solution

挑取平板上的菌落，做革兰氏染色，油镜镜检,待检菌为粗大杆菌，两侧平行，两端钝圆，直杆，芽孢为卵圆形，位于次级端，革兰氏染色阳性。孔雀石绿染色镜检后，芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。芽孢卵圆形，近中生，孢囊稍膨。图2，图3

图2 革兰氏染色油镜镜检结果

Fig.2 Microscopic result by G-strain method

图3 孔雀石绿染色镜检结果

Fig.3 Microscopic result by MalachiteGreen oxalate method

2.2 菌落的形态

米氏硫胺素芽孢杆菌在卵黄琼脂培养基平板上的菌落形态显示，菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层[15]。图4

图4 EYA平板上的菌落形态

Fig.4 The colony pattern on EYA medium

2.3 生化鉴定

根据硫胺素芽孢杆菌的生理生化特性，参照《伯杰细菌鉴定手册》[7]，初步鉴定为硫胺素芽孢杆菌。表1

表1 米氏硫胺素芽孢杆菌的生化鉴定结果

Table 1 The Physiological and biochemical Characteristics results ofAneurinibacillusmigulanus

培养基实际结果理论结果幼龄培养物呈杆状++芽孢形状椭圆椭圆包囊膨大++硝酸盐还原++接触酶++产生：吲哚--淀粉++尿素--卵黄卵磷脂酶--利用：柠檬酸盐利用++酪氨酸水解++发酵：葡萄糖++甘露醇--

注：“+”，阳性，“-”阴性

糖(醇)发酵实验结果显示葡萄糖培养基、乳糖培养基、七叶苷培养基管内的pH指示剂变色，反应为阳性；而麦芽糖培养基、甘露醇培养基、蔗糖培养基管内的pH指示剂不变色，反应为阴性。在明胶培养基明胶呈现固体状态，为阴性反应，在尿素培养基中培养基颜色无变化，为阴性反应。在柠檬酸盐的利用试验中，适温培养3～7 d后，培养基对光旋转呈蓝色，实验结果为阳性。将细菌接种到淀粉培养基培养24～48 h后，滴加碘液，菌落周围有不变色透明圈，淀粉水解呈阳性；接种到卵黄卵磷脂培养基培养24 h后,观察菌落四周没有浑浊环出现，表示卵磷脂未分解成脂肪，说明分离纯化的菌株中没有卵磷脂酶；将菌接种到硝酸盐还原为亚硝酸盐培养基24 h后，滴加试剂后，30 s内出现红色，表明细菌能从硝酸盐中提出氧将其还原为亚硝酸盐。将菌接种到吲哚培养基恒温培养24 h后，取出加入二甲苯和Ehrlish试剂,培养基不变色，实验结果为阴性。酪氨酸实验结果均为阳性。将24 h培养的斜面菌种接种在已滴有3%过氧化氢的玻片上，有气泡产生，实验结果为阳性。

2.4 细菌的16 s rDNA的鉴定结果

将测序所得到的序列去掉相关的载体序列后，得到米氏硫胺素芽孢杆菌的全长16 s rDNA的序列信息。该菌株的16 s rDNA长度为1 499 bp，将其结果提交到NCBI数据库进行核酸比对后，结果表明，该菌株与Aneurinibacillusmigulanus的16 s rDNA的相似性达到99%。根据上述结果，可以判定该菌株为Aneurinibacillusmigulanus。以下附上Aneurinibacillusmigulanu的16 s rDNA序列信息。图3

图3 菌株的16 s rDNA的全长序列

Fig.3 Complete sequences of Aneurinibacillus migulanus 16 s rDNA

GGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGCCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTT

GCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGT

ACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCG

GCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGGGATTC

GCGCACTCTCGCGAGTTGGCTGCCCGTTGTTCCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCA

GGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGTCTTGTCGACGGC

AGTCTCCCTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTT

GCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTC

ACCGCTGCTCCGAAGAGAGCTCCTATCTCTAGGAGGGTCAGCGGGATGTCAAGCCCTG

GTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCC

CGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGC

GTTAGCTGCGGCACTGAGGATTGGAGTCCCCAACACCTAGCACTCAACGTTTACGGCG

TGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGT

TACAGGCCAGAGAGCCGCCTTCGCCACGGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACC

GCTACACGTGGAATTCCGCTCTCCTCTCCTGCACTCAAGCTTCCCAGTTTCAAGTGGCC

CTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACACCTGACTTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTT

TACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG

TAGTTAGCCGGGGCTTTCTCGTTAGGTACCGTCAGACCGGGAGGTCATCCCGGCGGTT

CTTCCCTAACAACAGAACTTTACGATCCGAAAACCTTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTC

CGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGG

CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCT

TGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCTGTACGTGACC

AAAGGTCTTTCCCTTTCAGACCATGCGGTCTGAAAGAAGTATCCGGTATTAGCTCCGGT

TTCCCGGAGTTATCCCAGTCGTACAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCC

GCTAACCGCCGAAGAGCAAGCTCTTCATTGGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACG

CCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTC

3 讨 论

目前，微生物的鉴定方法主要有生化和分子生物学的鉴定。生化鉴定作为一种最经典、最普遍的鉴定方法而一直被使用，但是生化鉴定耗时很长、耗费也大，对于一些生理生化性质很接近的微生物则无法进行鉴定；且目前该数据库也是有限的，并没有涵盖所有的微生物的生化反应信息，也只能鉴定一些常见的微生物。硫胺素芽孢杆菌属有解硫胺素硫胺素芽孢杆菌、米氏硫胺素芽孢杆菌、嗜热气硫胺素芽孢杆菌3种。实验前部分所做的生化鉴定只能鉴定出该菌属于硫胺素芽孢杆菌属，无法精确其种类。

利用分子生物学的方法则更加的快速，准确，只需扩增一段微生物特异的一段DNA，短时间内就能给出结果，准确率也比较高，这在医疗领域用的很多。16 s rDNA的高度保守性使其有细菌化石之称，通过16 s rDNA的克隆和测序，可进一步准确判断其菌属。因此将分离纯化细菌的16 s rDNA送去测序。将测序结果在NCBI中进行比对，确定该菌是米氏硫胺素芽孢杆菌；OSAMU SHIDA等[16]通过16 s rRNA序列分析也得出同样结论。实验所用的引物为细菌专用的通用引物，加之PCR的假阳性的存在，很容易在扩增16 s rDNA的时候出现问题，造成结果误差。所以在实验进行中，对微生物的培养，单克隆的挑取，PCR反应体系和反应条件上进行了严格把控和条件摸索，16 s rDNA的扩增质量是有保证的，同时设置了阴性对照，保证了基于16 s rDNA序列的分析结果的准确性。

4 结 论

从土壤中分离、纯化得到的单菌落经革兰氏染色呈蓝紫色，表明该菌为革兰氏阳性菌，并且孔雀石绿染色结果表明该菌有芽孢；通过卵黄琼脂培养基培养、明胶培养基培养、糖(醇)发酵实验、柠檬酸盐的利用试验、硝酸盐还原实验等生化实验表明该菌为硫胺素芽孢杆菌属；利用DNA提取试剂盒中的说明书提取该菌基因组，并进行16 s rDNA扩增、送检，并将送检结果在NCBI/Blast比对序列，结果表明该菌是硫胺素芽孢杆菌属中的米氏硫胺素芽孢杆菌。

References)

[1]东秀珠,蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京:科学教育出版社,2001：56-57.

DONG Xiu-zhu, CAI miao-ying. (2001).Thecommon'sManualofDeteminativeBacteriology[M]. Beijing: Science Education Press：56-57. ( in Chinese)

[2]韩延平.需氧芽孢杆菌分类学研究进展[J].微生物学免疫学进展,2001,29(4):73-78.

HAN Yan-ping. (2001). Advances in classification of aerobic bacillus[J].ProgressinMicrobiologyandImmunology, 29(4): 73-78. ( in Chinese)

[3] Takagi, H. , Shida, O. , Kadowaki, K. , Komagata, K. , & Udaka, S.(1993). Characterization of Bacillus brevis with descriptions of Bacillus migulanus sp. nov., Bacillus choshinensis sp. nov., Bacillus parabrevis sp. nov., and Bacillus galactophilus sp. nov[J].IntJSystBacteriol, 43(2): 221-231.

[4]刘秀花.芽孢杆菌生物学及其应用[M].开封:河南大学出版社,2007：41.

LIU Xiu-hua. (2007).Bacillusbiologyanditsapplication[M]. Kaifeng: Henan University Press：41. ( in Chinese)

[5]刘佳文, 吕红艳. 16 S rRNA基因序列在分枝杆菌分类鉴定的研究进展[J]. 国外医学.临床生物化学与检验学分册, 2001,22(5): 265-266，268.

LIU Jia-wen, LV Hong-yan. (2001). Progress in the 16S rRNA gene sequence classification and identification of mycobacteria[J]. Foreign Medical Sciences,ClinicalBiochemistryandLaboratoryScienceVolume, 22 (05): 265-266，268. ( in Chinese)

[6]杨霞, 陈陆, 王川庆,等. 16S rRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2008,36(2): 55-60.

YANG Xia, CHEN Lu, WANG Chuan-qing, et al.(2008). Advances in gene sequence analysis techniques applied in bacterial 16S rRNA Classification[J].NorthwestAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEd. ), 36(2): 55-60. ( in Chinese)

[7]Berditsch, M. , Afonin, S. , & Ulrich, A. (2007). Ulrich.The Ability of Aneurinibacillus migulanus (Bacillus brevis)To Produce the Antibiotic Gramicidin S Is Correlated with Phenotype Variation[J].AmericanSocietyforMicrobiology, 73(20):6，620-6，628.

[8]Mogi, T. , & Kita, K. (2009). Gramicidin S and polymyxins: the revival of cationic cyclic peptide antibiotics[J].CellMolLifeSci, 66(23):3，821-3，827.

[9] 丁若垚,张兴群. 一种利用米氏硫胺素芽孢杆菌DY3菌株沤麻制备红麻纤维的方法：中国, 201410334155.9 [P]. 2014-07-14.

DING Ruo-yao, ZHANG Xing-qun. (2014).AuseAneurinibacillusmigulanusDY3strainrettingkenaffiberpreparationmethod[P]: China, 201410334155.9. 2014-07-14. ( in Chinese)

[10]陈艳玲. 一种EM菌的组成鉴定及应用初探[D].舟山:浙江海洋学院硕士研究生毕业论文，2014.

CHEN Yan-ling. (2014). A EM bacteria constituting Identification and application[D]. Master Thesis.ZhejiangOceanUniversity,Zhoushan. ( in Chinese)

[11]梅汝鸿,徐维敏.植物微生态学[M].北京:中国农业出版社,1998：104-105.

MEI Ru-hong, XV Wei-mei. (1998).Plantmicro-ecology[M]. Beijing: China Agriculture Press：104-105. ( in Chinese)

[12]黄劲,王和. 用PCR扩增16 S rRNA基因鉴定甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株[J]. 贵阳医学院学报, 2006,31(4): 333-335.

HUANG Jin, WANG He. (2006). The Identification of Cell Wall Deficient Mutants of Salmonella paratyphi A with 16S rRNA Gene Amplified by PCR[J].JournalofGuiyangMedicalCollege, 31 (4): 333-335. ( in Chinese)

[13]常洪涛,刘慧敏,杜继梅,等. 地方土猪源副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因的分子鉴定及遗传进化分析[J]. 中国畜牧兽医, 2013,40(11):157-160.

CHANG Hong-tao, LIU Hui-mei, DU Ji-mei, et al. (2013). Molecular Identification and Genetic Evolution Analysis of Haemophilus parasuis 16S RNA Gene in Local Pig Origin[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 40 (11):157-160. ( in Chinese)

[14]Hua Zhou ,Yihong Shen ,Qian Shen , & Jianying Zhou (2015). Thoracic empyema caused by Prevotella spp. diagnosed using 16S rDNA sequence analysis[J].TheClinicalRespiratoryJournal, 9(1): 121-124.

[15]崔国权，杨超. 新编卫生应急事件预防控制技术[M].长春:吉林人民出版社, 2009：94.

CUI Guo-quan, YANG Chao. (2009).Newsanitationemergenciespreventionandcontroltechnology[M]. Changchun: Jilin People Press：94. ( in Chinese)

[16]SHIDA, O. ,TAKAGI, H. ,KADOWAKI, K. , KOMAGATA, K.(1996). Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov[J].IntJSystBacteriol, 46(4):939-946.

Fund project:Supported by NSFC (30690277) and the Basic Science and Technology Application Program of XPCC (2007JC07)

Isolation and Identification ofAneurinibacillusmigulanus

ZHANG Jing1，XU Hong-wei1，ZENG Guo-hang1,SONG Xian-ming1,AI Dong-xu1,LI Lian-rui2,3

(1.CollegeofLifeScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China; 2.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China;3.KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProductionandConstructionCorps,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 To isolate and purify bacteria in soil in the hope of obtainingAneurinibacillusmigulanusthrough the process of identification. 【Method】 By biochemical identification, extracting bacterial genome, sequencing 16 s rDNA of bacterial methods to identify the bacteria. 【Result】 This bacterial biochemical identification results were consistent with theoretical results of "berger bacteria identification manual" about biochemical identification ofAneurinibacillusmigulanus, and then bacterial 16 s rDNA sequencing results were compared on the NCBI. 【Conclusion】 Bacteria isolated and purified were determined to beAneurinibacillusmigulanusby comparison of the sequenced bacillus.

bacteria separation；bacteria identification；16 s rDNA；Aneurinibacillusmigulanus

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.008

2015-07-13

国家自然科学基金项目(30690277)；兵团应用基础项目(2007JC07)

张晶(1991-)，女，新疆奎屯人，研究生，研究方向为畜禽病原及免疫学，(E-mail)573722063@qq.com

李莲瑞(1968 - )，女，新疆人，教授，博士，硕士生导师，研究方向为畜禽病原及免疫学，(E -mail)lilianrui51@163.com

S188

A

1001-4330(2016)01-0059-09