新疆番茄晚疫病原菌交配型鉴定及其对甲霜灵敏感性测定

何 伟，杨 华，崔元玗，孙晓军，许建军

(新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)

新疆番茄晚疫病原菌交配型鉴定及其对甲霜灵敏感性测定

何 伟，杨 华，崔元玗，孙晓军，许建军

(新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)

【目的】鉴定2011至2015年新疆阿克苏、疏勒、叶城等地的晚疫病原菌交配型并测定病原菌对甲霜灵敏感性，掌握P.infestans种群在新疆是否有有性生殖存在，为番茄晚疫病的防治药剂筛选和轮换，以及防治策略的制定提供科学依据。【方法】采集番茄的病害部位(病果、病叶和病茎)，在燕麦培养基上对其进行组织分离保存，采用对峙培养法鉴定保存菌株交配型，采用含药平板法测定保存菌株敏感性。【结果】阿克苏市、疏勒县、叶城县和墨玉县温室采集样品分离保存的37个菌株均为A1交配型，无A2交配型和自育型菌株。37个番茄晚疫病菌菌株中，敏感菌占总数的0%，中抗菌株占35.14%，抗性菌株占64.86%。抗性菌株的抗性水平都在1.8×103倍以上。【结论】在自然条件下阿克苏市、墨玉县、叶城县和疏勒县等地番茄晚疫病菌没有有性生殖发生，番茄晚疫病菌对甲霜灵具有较高抗性。

番茄晚疫病；交配型；敏感性

0 引 言

【研究意义】番茄晚疫病又称番茄疫病，由致病疫霉(Phytophthorainfestans( Mont. ) De Bary)侵染所致。它是一种世界毁灭性的蔬菜病害，尼日利亚、日本、加拿大、美国和瑞士等国家对该病严重危害性均有报道。我国北京、山西、云南、贵州、山东、陕西、河南、河北等省市晚疫病普遍发生，且危害严重[1-3]。近年来，随着新疆设施蔬菜规模的迅速发展，新疆设施面积不断增加，设施蔬菜病害种类不断增多，给新疆设施蔬菜生产造成严重损失。2011年12月和2012年3月在喀什地区英吉沙县和疏勒县温室中番茄上发生的病害是由疫霉(Phytophthorainfestans)侵染引发的番茄晚疫病[4]。掌握新疆阿克苏市、疏勒县、叶城县和墨玉县等地的晚疫病原菌交配型并测定病原菌对甲霜灵敏感性，了解P.infestans种群在新疆是否有有性生殖存在，为番茄晚疫病的防治药剂筛选和轮换，以及防治策略的制定提供科学依据。【前人研究进展】Niederhauser 等在1956年首次报道墨西哥发现A2 交配型，此后直到1984年，瑞士发现 A2 交配型，随后日本、英国、荷兰、波兰、美国、加拿大等国家也相继发现 A2 交配型的存在[5-6]。1996年，张志铭等[7]报道在北京、内蒙、山西和云南等省区发现致病疫霉A2交配型，K．Y．RYU等[8]对云南省的致病疫霉进行交配型，发现了3个菌株为 A2交配型。杨宇红等[9]对我国主要番茄产区晚疫病菌交配型进行了鉴定，结果表明目前我国番茄晚疫病菌仍以A1交配型为主，番茄晚疫病菌A2交配型仅在少数省份与地区被发现，并且其数量很少。甲霜灵(Metalaxyl)是苯基酰胺类杀菌剂，对卵菌具很高的活性，可有效地预防和控制晚疫病的发生，但其连续施用多年后，病原菌易产生抗药性。抗药性菌株的产生在生产上直接表现为药效下降甚至失效，因此抗药性发展是晚疫病防治的一个重要问题。芬兰于1980年首次检测到马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的抗性，随后美国、以色列、丹麦等地相继发现抗药性菌株。【本研究切入点】目前，未见关于新疆番茄晚疫病菌交配型和其对甲霜灵抗性的报道，研究对新疆番茄晚疫病菌交配型和其对甲霜灵抗性进行鉴定和测定。【拟解决的关键问题】掌握新疆番茄晚疫病菌的交配型和其对甲霜灵抗性情况，为生产上药剂筛选与防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样 本

2011至2015年，在番茄晚疫病发病盛期，从新疆主要番茄产区的温室中采集具有典型晚疫病症状的茎，叶或果实，一般从每块田地中随机采集5～15个病样，装入样本袋后迅速带回实验室内进行分离。每个标样记录采集地点、日期、采集者、名称等。

1.1.2 燕麦培养基

参照方中达的《植病研究方法》[10]，燕麦选择性培养基:待基础培养基冷却至50℃左右，加入利福平(20 mg/L)、氨卞青霉素(200 mg/L)和制霉菌素(100 mg/L)，混匀，倒平皿。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分离与纯化

将番茄晚疫病果或病茎用3%次氯酸钠浸泡2～3 min，无菌水冲洗2～3次，剪取病健交界处0.5 cm2大小，放入含有抗生素的选择性燕麦培养基平板上，在19～22℃条件下培养5～7 d，挑取菌丝在显微镜下观察，并移植相应的菌块到培养基上，在19～22℃条件下培养。并且进行纯化保存[11]。

1.2.2 交配型测定

采取“对峙培养法”测定待测晚疫病菌菌株的交配型，用福建农业科学院植物保护研究所陈庆河研究员提供的A430和P7330菌株分别作为番茄晚疫病菌A1交配型和A2交配型的标准菌株。采用直径为5 mm打孔器打取菌龄相同的待测菌株块与标准菌株块，将两菌块相距1.5～2 cm对峙培养于燕麦培养基，于19～21℃条件下黑暗培养15 d左右，将培养平板置于显微镜下观察卵孢子形成情况及结构特征。

交配型鉴定标准：与A1交配型标准菌株产生卵孢子的待测菌株为A2交配型；与A2交配型标准菌株产生卵孢子的待测菌株则为A1交配型；与A1、A2交配型标准菌株均产生卵孢子并且同一待测菌株两菌块对峙培养也产生卵孢子的待测菌株为自育菌株。

1.2.3 番茄晚疫病菌对甲霜灵的敏感性测定

1.2.3.1 甲霜灵抗性

供试菌株共37个菌株用于甲霜灵抗性测定，供试药剂为75%甲霜灵(Metalaxyl，Ridomil又名瑞毒霉)(德国拜耳)。试验采取生长速率法[12]，将晚疫病菌转接在燕麦培养基上，在19～21℃条件下黑暗培养15 d左右，采用直径5 mm的打孔器在燕麦平板上打取菌块，分别移到含甲霜灵0、5 和100 μg/mL的燕麦平板中央，置于19～21℃培养，每处理重复3次，7 d后测定菌落生长量。抗性测定标准：含药5和100 μg/mL平板上菌落生长量均≥40%对照生长量为抗性；两者均≤40%，为敏感；含药5 μg/mL平板上菌落生长量≥40%对照生长量≥含药100 μg/mL平板上菌落生长量，为中度抗性[13]。

1.2.3.2 甲霜灵抗性水平

将所选菌株在燕麦培养基平板上培养10 d，采用直径5 mm打孔器沿菌落边缘打取菌块，抗性菌株分别移到含甲霜灵0、10、20、40、80、160、320 μg/mL的燕麦培养基平板上，敏感菌株分别移到含甲霜灵0、0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL的燕麦选择性培养基上，置于19～21℃培养，每处理重复3次，7 d后测定菌落生长量。

1.3 数据统计

采用SPSS软件进行回归分析，计算各菌株的EC50值，以抗性菌株的EC50值与敏感菌株的EC50值之比计算各抗性菌株的抗性水平。

2 结果与分析

2.1 番茄晚疫病交配型

对2011～2015年度在阿克苏市、墨玉县、疏勒县和叶城县采集样本分离获得的37个番茄晚疫病菌菌株分别与A430(A1)和P7330(A2)标准菌株进行对峙培养，鉴定交配型。试验结果表明，阿克苏市温室番茄晚疫病菌13个菌株、疏勒县温室12个番茄晚疫病菌菌株和叶城县温室番茄晚疫病菌7个菌株、墨玉县的5个菌株与A1交配型标准菌株对峙培养之后不产生卵孢子，但与A2交配型标准菌株对峙培养之后全部产生卵孢子，因此该37个菌株全部是A1交配型。表1

2.2 番茄晚疫病抗性

研究表明，阿克苏市、墨玉县、疏勒县和叶城县等地温室采集分离的37个番茄晚疫病菌菌株中，敏感菌株为0株，占总数的0%，中抗菌株为13株，占35.14 %，抗性菌株为24株，占64.86%。墨玉县温室番茄晚疫病菌全部菌株为抗性菌株，阿克苏市和墨玉县番茄晚疫病菌菌株抗性菌株分别为76.93%和71.43%，疏勒县番茄晚疫病菌菌株中抗菌株较多，所占比例为66.7%。表2

表1 不同地区番茄晚疫病菌交配型

Table 1 Mating type ofP.infestansin different areas

采集地点Collectionsites菌株数量Numberofstrains交配型MatingtypeA1A2阿克苏市Akesu13130疏勒县Shule12120叶城县Yecheng770墨玉县Moyu550

表2 不同地区番茄晚疫病菌对甲霜灵抗性测定结果

Table 2 Resistance determination results ofP.infestansto Metalaxyl in different parts

2.3 抗性菌株的抗性水平

3个抗性菌株的EC50值最低为1.417 6 g/mL，最高达1.990 4 g/mL。试验中未出现敏感菌株，查阅参考文献，以毕朝位报道中TBS-2131为敏感对照菌株[13]，其EC50值为0.000 81，求得各抗性菌株的抗性水平都在1.8×103倍以上，由此可以看出当地番茄晚疫病菌甲霜灵抗性水平较高。墨玉县番茄晚疫病菌菌株抗性水平最高，为2.5×103，疏勒县番茄晚疫病菌菌株抗性水平最低。表3

表3 部分抗性菌株对甲霜灵抗性水平

Table 3 Resistance level of parts resistant strains toMetalaxyl

菌株编号Strainnumber采集地点Collectionsites毒力回归方程Virulenceregressionequation相关系数RCoefficientofassociationEC50(g/mL)抗性水平Resistancelevelsl2012-7疏勒县Y=3 9216+0 7608X0 97411 41761 8×103my2014-7墨玉县Y=2 1685+1 4226X0 87281 99042 5×103aks2013-1阿克苏Y=3 8445+0 6462X0 97901 78812 2×103Yc2014-3叶城县Y=3 8632+0 6865X0 95701 75462 2×103

3 讨 论

自1956年，墨西哥首次发现晚疫病菌A2交配型以来，荷兰、日本、加拿大、美国、瑞士和中国等国家和地区先后发现A2交配型，但我国我国A2交配型总体数量很少，目前仍以A1交配型菌株为主。新疆尚未见有关晚疫病菌交配型的报道，近几年新疆设施番茄发生番茄晚疫病，墨玉县，叶城县、疏勒县和阿克苏市番茄晚疫病菌仅有A1交配型存在，但是受分离菌株数量不多的影响，这还不能说明新疆其它地区在自然条件下没有晚疫病菌A2交配型菌株的出现。要检测新疆是否有A2交配型菌株出现，并进一步检测在自然条件下是否发生了有性生殖，还需要进一步采集更多地点与更多数量的菌株，进行更多菌株交配型的鉴定与综合分析。

番茄晚疫病的防治药剂主要以苯酰胺类杀菌剂为主，甲霜灵的生物活性、内吸性和持效期较同类其他化合物好，因此生产上被用作防治番茄晚疫病的主要药剂，但其具有易产生抗药性和作用位点单一的缺点。晚疫病菌对甲霜灵的抗性可以伴随新的群体的产生或迁移而出现在众多番茄产区[14]。新疆设施番茄晚疫病虽然是近年来新发生的一种病害，但其也存在对甲霜灵抗性的可能。研究中的番茄晚疫病菌无敏感型，多为抗性菌株，而新疆南部地区设施蔬菜用药水平低，因此，番茄晚疫病菌对甲霜灵的抗性很可能是伴随着群体的迁移而产生的。

4 结 论

目前，初步判断新疆阿克苏市、墨玉县、叶城县和疏勒县等地番茄晚疫病菌在自然条件下没有有性生殖的发生。番茄晚疫病菌A2交配型的出现将促使当地番茄晚疫病菌生理小种的组成更加复杂，因此，掌握当地番茄晚疫病菌交配型变化对生产上抗病品种的应用具有重要指导意义。

墨玉县、和田市和阿克苏市番茄晚疫病菌对甲霜灵具有较高抗性。新疆南疆地区未见番茄晚疫病的发生报道，现在发生危害严重，该病菌可能由于引种从外地传来，因此检测番茄晚疫病菌对甲霜灵的抗性，对番茄晚疫病的防治药剂筛选和轮换，以及防治策略的制定等具有重要的指导意义。

References)

[1] 曹继芬，孙道旺，杨明英，等．云南番茄致病疫霉的交配型、甲霜灵敏感性及毒力类型[J]．菌物学报，2006，25(3)：488-495．

CAO Ji-fen, SUN Dao-wang, YANG Ming-ying, et al. (2006). Metalaxyl sensitivity and geographical distribution ofPhytophthorainfestanson potato and tomato in Yunnan [J].Mycosystema, 25(3): 488-495. (in Chinese)

[2] 毛爱军，柴敏，于拴仓,等．北京地区番茄晚疫病新菌株致病性鉴定及部分主栽品种与品系的抗性评价[J]．华北农学报，2005，20(4)：98-101．

MAO Ai-jun, CHAI Min, YU Shuan-cang, et al. (2005). Pathogenicity of a new isolate ofPhytophthorainfestansfrom Beijing and resistance evaluation of tomato materials [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica, 20(4): 98-101. (in Chinese)

[3] 王文桥，马志强，张小风，等．致病疫霉抗药性、交配型和适合度[J]．植物病理学报，2002，32(3)：278-283．

WANG Wen-qiao, MA Zhi-qiang, ZHANG Xiao-feng, et al. (2002). Resistance to fungicides mating types and fitness of Phytophthora infestans [J].ActaPhytopathologicaSinica, 32(3): 278-283. (in Chinese)

[4] 何伟，杨华，张升,等．一种新疆设施番茄新病害病原的分离与鉴定[J]．新疆农业科学，2013，50(6)：1 095-1 100．

HE Wei, YANG Hua, ZHANG Sheng, et al. (2013).Isolation and Identification of Pathogens of a New Tomato Diseases in Greenhouse in Xinjiang[J].XinjiangAgriculturalSciences, 50(6): 1，095-1，100. (in Chinese)

[5] Shaw, D. S., Fyfe, A. M., Hibberd, P. G., & Abdel-Sattar, M. A. (2007). Occurrence of the rare a2 mating type of phvtophthora infestans on imported egyptian potatoes and production of sexual progeny with a i mating types from the UK.PlantPathology, 34(4)：552-556.

[6] Fry W E, Goodwin S B, Dyer A T, et a1. Historical and recent migration ofPhytophthorainfestans: chronology, pathways and implications [J].Plantdisease, 1993,77: 653-656.

[7] 张志铭，李玉琴，田世民,等．中国发生马铃薯晚疫病菌A2交配型[J]．河北农业大学学报，1996，(1)：62-66．

ZHANG Zhi-ming, LI Yu-qin, TIAN Shi-min, et al. (1996).The occurrence of potato late blight pathogen (Phytophthorainfestans) A2 mating type in China [J].JournalofAgriculturalUniversityofHebei, (1): 62-66. (in Chinese)

[8] K.Y.RYU，罗文富，杨艳丽,等．云南省马铃薯晚疫病菌的交配型、抗药性及生理小种分布的研究[J]．植物病理学报，2003，33(2)：126-131．

K. Y. RYU, LUO Wen-fu, YANG Yan-li, et al. (2003).Mating type, fungicide sensitivity and physiological race ofPhytophthorainfestanscollected from Yunnan Province [J].ActaPhytopathologicaSinica, 33(2):126-131. (in Chinese)

[9] 杨宇红，谢丙炎，冯香兰,等．中国番茄晚疫病菌交配型及其分配研究[J]．菌物学报，2004，23(3)：351-355．

YANG Yu-hong, XIE Bing-yan, FENG Lan-xiang, et al. (2004). Mating types and their distribution ofPhytophthorainfestansfrom tomato in China[J].Mycosystema, 23(3):351-355. (in Chinese)

[10] 方中达．植病研究方法(第三版)[M]．北京：中国农业出版社，1997：82．

FANG Zhong-da. (1997).PlantDiseaseResearchMethods(3rded.) [M]. Beijing: China Agriculture Press：82. (in Chinese)

[11] 吴涛，朱海山．番茄晚疫病菌的分离、扩繁及人工接种研究[J]．云南农业大学学报，2000，20(5)：655-658．

WU Tao, ZHU Hai-shan. (2000). Studies on isolation, propagation and inoculation ofPhytophthorainfestanson tomato [J].JournalofYunnanAgriculturalUniversity, 20(5): 655-658. (in Chinese)

[12] 沈江卫，杨志辉，朱杰华，等．马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯和精甲霜灵的敏感性测定[J]．农药，2008，47(6)：458-461.

Shen jiang-wei, Yang zhi-hui, Zhu jie-hua et al. Detection on the Sensitivity of Phytophthora infestans to Azoxystrobin and Metalaxgl-M[J].Agrochemicals, 2008, 47(6): 458-461.

[13] 毕朝位，王中康，车兴壁,等．番茄晚疫病菌(Phytophthorainfestans)对甲霜灵的抗性测定及治理[J]．西南农业学报，2003，16(1)：68-70．

BI Chao-wei, WANG Zhong-kang, CHE Xing-bi, et al. (2003). Resistance ofPhytophthorainfestansto Metalaxyl and the strategy for control [J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences, 16(1): 68-70. (in Chinese)

[14] Shattock, R. C. (2002).Phytophthorainfestans: populations, pathogenicity and phenylamides..PestManagementScience, 58(9)：944-950.

Fund project:Supported by the Open Fund of Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Oasis, Ministry of Agriculture, P. R. China, (KFJJ20150101) and the Special Scientific Research Project of of Xinjiang Uygur Autonomous Region Science and Technology Program,(201130104-3)

Identification of Mating Type and Measure of Sensitivity of Metalaxyl toPhytophthorainfestansin Xinjiang

HE Wei，YANG Hua，CUI Yuan-yu， SUN Xiao-jun，XU Jian-jun

(ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgricultural/KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.ChinaSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 This project aims to identify mating type and resistant levels ofPhytophthorainfestansto Metalaxyl in Akesu, Shule, Yecheng and master sexual reproduction existence of theP.infestanspopulation in Xinjiang from 2011 to 2015, thus providing scientific basis for medication screening and rotation for prevention and treatment of tomato late blight and the establishment of certain control strategy. provided scientific basis.【Method】Samples of tomato late blight were collected and separated by tissue preservation, and the mating type was identified by inhibitony activity in vitro to measure the resistance level by medicated tablet method.【Result】All the 37 strains of samples in Akesu, Moyu, Shule and Yecheng by separation preservation were A1 mating type, no A2 mating type and bred type. Test results of sensitive measurement of Metalaxyl showed that among the 37 tomato late blight fungus strains, the sensitive strain was 0%, the medium resistance strain was 35.14%, resistant strain was 64.86%. The resistance level of the resistance strain was higher than 1.8×103.【Conclusion】Preliminary judgment was made that there was no sexual reproduction under the natural condition in Akesu City, Moyu County, Yecheng County and Shule County at present and metalaxyl had high resistance toPhytophthorainfestans.

Phytophthorainfestans；mating type；sensitivity

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.003

2015-04-32

农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室开放基金(KFJJ20150101) ；新疆维吾尔自治区“十二五”重大专项(201130104-3)

何伟(1980-)，男，安徽阜阳人，助理研究员，硕士，研究方向为蔬菜病虫害防治，(E-mail)hewei_888y@yahoo.com.cn

崔元玗(1955-)，女，新疆乌鲁木齐人，研究员，研究方向为蔬菜病虫害防治，(E-mail)cuiyuanyu@126.com

S436.412

A

1001-4330(2016)01-0016-06