程序化和玻璃化冻融人卵裂期胚胎的临床应用效果比较

邱孙全

浙江大学医学院附属妇产科医院 浙江省杭州市 310000

程序化和玻璃化冻融人卵裂期胚胎的临床应用效果比较

邱孙全

浙江大学医学院附属妇产科医院 浙江省杭州市 310000

目的：探讨程序化和玻璃化冻融卵裂期胚胎的效果及临床结局。方法：结果：玻璃化组的胚胎复苏存活率高于程序化组，而周期取消率较低。在临床结局上，玻璃化组的胚胎植入率与程序化组无显著差异，而临床妊娠率相比较高。结论：玻璃化法冻融卵裂期胚胎优于程序化法，可获得更高的临床妊娠率。

玻璃化；程序化；卵裂期胚胎；体外受精-胚胎移植

自1984年首例冻融人类胚胎成功妊娠后，胚胎冷冻-复苏技术不断发展。目前应用于临床的胚胎冻融方法主要有慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻。相比程序化，玻璃化冷冻操作时间短，并且不需要价格高昂的程序化冷冻仪。而短时间内高浓度的玻璃化冷冻液是否会影响胚胎的发育潜能，仍有待更多的研究。本研究回顾性分析本中心的1154例胚胎冻融周期的临床结果，比较两种冻融方法的冷冻复苏效果及临床结局，以期为临床上选择适宜的冻融方法提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

对2015年1月至2015年6月期间在本中心接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的1154个冷冻-复苏周期。其中程序化冷冻813例，玻璃化冷冻341例。

1.2 研究方法

1.2.1 程序化冷冻

试剂为FreezeKit Cleave和ThawKit Cleave（Vitrolife, 瑞典）。使用英国Planer程序降温仪进行程序化冷冻。将胚胎置入ES3min，移入FS放置8min后装管并放入程序降温仪，以-2℃/min降温至-7℃，植冰，然后以-0.3℃/min降温至-30℃，之后以-30℃/min降温至-150℃，取出迅速投入液氮中保存。解冻时，将麦管从液氮中取出，室温30s，30℃水浴40s，取出将胚胎按序移入TS1、TS2和ES各5min，转入培养液中置于CO2培养箱。

1.2.2 玻璃化冷冻

试剂为MediCult Vitrifcation Cooling和Medicult Vitrifcation Warming（Origio，丹麦）。冷冻时，将胚胎放入BS 1min，转入ES 7min，然后移入VS漂洗数次并于1min内将胚胎滴在载杆上，迅速投入液氮保存。解冻时，将装有胚胎的载杆从液氮中取出，迅速置入37℃的VS1,1min后按顺序移入VS2、VS3、VS4，分别放置3min，转入培养液中置于CO2培养箱。

1.2.3 胚胎移植

采用自然周期、激素替代法或hMG/ hCG促排卵周期准备内膜。移植后进行黄体支持，至4周后行B超检查妊娠囊。

1.3 统计学方法

2 结果

（1）将1154例胚胎冻融移植周期分为程序化和玻璃化冷冻组，周期数分别为813和341。比较两组的患者基本资料，包括年龄（31.18±3.37～30.92±3.71，P>0.05）、不孕年限（3.98±2.15～3.77±2.56，P>0.05）和内膜厚度（9.16±1.64～9.32±1.73，P>0.05）等，均无显著差异。

（2）比较两组的胚胎冷冻-复苏存活率和移植周期取消率，以及行胚胎移植术后的胚胎植入率和临床妊娠率。结果显示，玻璃化组的胚胎复苏存活率高于程序化组（93.0%～81.2%，P<0.05），而周期取消率较低（2.6%～4.9%，P<0.05）。在临床结局上，玻璃化组的胚胎植入率与程序化组无显著差异（26.3%～25.3%，P>0.05），而临床妊娠率相比较高（51.2%～45.9%，P<0.05）。

3 讨论

胚胎冻融技术可最大限度地利用胚胎，使一次取卵周期可能获得多次胚胎移植机会，提高临床累计妊娠率。目前，常用的胚胎冷冻为程序化冷冻法和玻璃化冷冻法。程序化法临床应用较早，主要通过使用程序降温仪来实现胚胎细胞的脱水。然而冷冻过程难以完全避免胞内冰晶的产生从而对胚胎造成损伤。玻璃化冷冻室利用高浓度的冷冻保护剂，使胚胎胞内液体变为玻璃化状态，从而避免冰晶形成。与程序化法相比，玻璃化冷冻法无需昂贵的设备，操作简便，冷冻过程耗时较短[1]。而高浓度冷冻保护剂的使用会加大细胞毒性，其对胚胎后续发育的影响有待研究。

本研究选取1154例冰冻胚胎移植周期，并根据冷冻方法进行分组分析，发现玻璃化冻融法获得的胚胎复苏存活率比程序化法高（93.0%～81.2%），而移植周期取消率较低（2.6%～4.9%）。这一结果与国内外多数学者的研究结果一致[2-4]。临床结局方面，比较两组的胚胎植入率，结果显示无显著差异（26.3%～25.3%，P>0.05）。可能的原因是：高浓度的DMSO（二甲基砜）作为冷冻保护剂，对细胞具有潜在的毒性，研究表明DMSO可提高胚胎的甲基化水平，从而影响胚胎的发育过程。相比程序化法，玻璃化法冻融的胚胎可获得更高的临床妊娠率（51.2%～45.9%）。这可能是因为玻璃化冻融的胚胎存活率相比程序化法较高。

程序化冻融胚胎在临床的应用已有30多年时间，其安全性已得到公认。而玻璃化法的应用时间较短，其安全性一直为辅助生殖领域所关注，包括婴儿出生缺陷、体重、发育等健康状况[5-7]。其后续影响值得进一步研究。

综上所述，玻璃化冻融胚胎技术比程序化法具有较高的冷冻-复苏率，且可获得更高的临床妊娠率。而对于后代安全性，仍需长期随访和后续研究。

[1]Liebermann J,Nawroth F,Isachenko V,et al.Potential importance of vitrification in reproductive medicine[J].Biol Reprod,2002, 67(06):1671-80.

[2]Kuwayama M,Vajta G,Ieda S, et al.Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination [J]. Reprod Biomed Online,2005,11(05):608-14.

[3]郑群,程兆俊,邹立波等.玻璃化冷冻法和程序化冷冻法对人卵裂期胚胎冷冻复苏效果及临床结局的比较[J].中国优生与遗传杂志,2016,24(01):118-97.

[4]Shi W,Xue X,Zhang S,et al. Perinatal and neonatal outcomes of 494babies delivered from 972 vitrified embryo transfers[J]. Fertil Steril,2012,97(06):1338-42.

[5]Wikland M, Hardarson T, Hillensjö T, et al. Obstetric outcomes after transfer of vitrified blastocysts [J]. Hum Reprod,2010,25(07):1699-707.

[6]Kato O,Kawasaki N,Bodri D,et al.Neonatal outcome and birth defects in 6623 singletons born following minimal ovarian stimulation and vitrified versus fresh single embryo transfer [J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2012,161(01):46-50.

[7]罗小平,章汉旺.冻融技术的安全性回顾分析—复苏胚胎与新鲜胚胎的对比研究[J].实用妇产科杂志,2008, 24(03):191-4.