5-磷酸二酯酶抑制剂对噪声性聋影响的实验研究

梁媛张淑君张勋尹桂茹陆鸿略王伟杰范伟承德医学院附属医院耳鼻咽喉科067000河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科05005承德市滦平县医院06850承德市市场监督管理局067000



5-磷酸二酯酶抑制剂对噪声性聋影响的实验研究

梁媛1张淑君1张勋2尹桂茹1陆鸿略1王伟杰3范伟4
1承德医学院附属医院耳鼻咽喉科067000
2河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科050051
3承德市滦平县医院068250
4承德市市场监督管理局067000

【摘要】目的探讨5-磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂对豚鼠噪声性聋的影响。方法豚鼠随机数字表法分为对照组、噪声暴露组和西地那非给药组，每组15只。西地那非组及噪声组豚鼠在白噪声暴露1周后分别腹腔注射西地那非10 mg/（kg.d）及生理盐水4 ml/（kg.d），连续给药4周。分别测试噪声暴露前1天、噪声暴露后1、2及4周听性脑干反应(ABR)阈值及80dB HL下ABRⅠ波潜伏期,并通过扫描电镜观察噪声暴露后4周豚鼠耳蜗毛细胞的形态变化。结果与噪声暴露前相比，西地那非组ABR阈值及Ⅰ波潜伏期均小于噪声组，差异具有统计学意义(P值均<0.01)。扫描电镜显示，噪声组豚鼠耳蜗内、外毛细胞均出现听毛紊乱、融合及缺失；而西地那非组耳蜗病变较轻，听毛仅有轻微倒伏、融合现象。结论西地那非能够减轻噪声对豚鼠耳蜗毛细胞的损害，降低噪声性听觉损伤引起的ABR阈值升高，缩短其引起的Ⅰ波潜伏期延长。

【关键词】5-磷酸二酯酶抑制剂；噪声性聋；耳蜗；毛细胞；听性脑干反应

在现代社会，噪声污染已成为一个影响人类健康的重大公共卫生问题，而听力损害是噪声暴露的一种主要功能障碍形式，其中噪声对听觉系统的损害多表现为噪声性聋(noise-induced hearing loss,NHIL)[1]。其发病机制主要有机械学说、血管学说、代谢学说等。许多生理学证据已经证明耳蜗中存在NO/cGMP途径，其作为信号转导系统参与调节耳蜗微循环、支持细胞生理及耳蜗放大效应。对于噪声性听力损伤的防治，已有学者在增加血流量、供给高能化合物及氧、提高对噪声的耐受力等方面进行了研究，但迄今尚无理想的药物防治。

5-磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂通过增强NO/cGMP途径，升高cGMP水平，从而起到扩张血管平滑肌的作用。在临床上，它被广泛应用于治疗阴茎勃起功能障碍，同时，人们还研究并探讨了其在心血管系统、肺功能、呼吸系统、视觉、镇痛方面的影响，但在听觉损伤方面尚无系统的报道。Jaumamm等[2]首次在耳蜗中发现PDE5蛋白高表达，并与环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶-1（Prkg1）编码基因部分共定位。本实验旨在采用白噪声制造动物模型，通过听觉电生理及形态学方法，探讨5-磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂在噪声引起的听力损失中的作用，并分析其可能机制。

1　材料及方法

1.1主要试剂和仪器

枸橼酸西地那非(美国辉瑞,批号:C070652)，Key⁃ponit型4通道听觉脑干诱发电位仪（Dantec，丹麦),扫描电子显微镜(S-3500N SEM，日立，日本)，解剖显微镜(Mnler显微镜，德国)。

2　动物分组及前期处理

选择耳廓反射灵敏的健康杂色雄性豚鼠45只(承德医学院实验动物中心提供),体重250～310g。随机数字表法分为正常对照组、噪声暴露组和西地那非给药组，每组15只。各组豚鼠在经戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉及无菌条件下于颅顶部双侧皮层听区硬膜外手术埋植不锈钢丝慢性电极（记录电极）,牙科水泥固定,稳定1周后进行实验。

3　噪声暴露

噪声暴露组和西地那非给药组豚鼠暴露于噪声1周。将豚鼠置于自制小笼内(20 cm×20 cm×20 cm)，每笼1只，放入暴露舱(26 m3)中；由信号发生器产生20～2000 Hz的白噪声，经GY型400W扩音器放大,并由扬声器组向暴露舱播放；暴露时用B&K 2107型频率分析仪连续监测，暴露声压级为110dB A，动物暴露范围内声场不均匀度为±1 dB。豚鼠每日暴露1 次,每次2 h,连续暴露1周。对照组豚鼠安静环境中饲养，未给予噪声暴露。

4　动物给药

豚鼠经噪声暴露结束后即开始给药，噪声暴露组腹腔注射生理盐水(4 ml/kg,每日1次)，西地那非组豚鼠腹腔注射西地那非10 mg/kg(将西地那非用生理盐水稀释，4 ml/kg，每日1次)，连续给药4周。

5　听性脑干反应（ABR）测试

动物保持清醒状态,半限制于测试笼中,置于隔声电屏蔽室内。分别于噪声暴露前1 d，药物干预后第1、2、4周进行ABR阈值测试。对照组在相同时间点测试。记录电极置于颅顶部，参考电极和接地电极分别置于同侧和对侧乳突部。滤波带通30～3000 Hz，叠加1024次，扫描时间15 ms。采用0.1 ms方波脉冲刺激声，频率20 Hz，以Ⅲ波刚刚出现时的刺激强度作为ABR阈值。同时记录Ⅰ波潜伏期，即80dB nHL下ABRⅠ波出现时的时间。

6　扫描电镜标本制作

从3组中任意选取5只豚鼠,取其左耳耳蜗作为扫描电镜观察对象。豚鼠完成最后给药及ABR测试后(噪声暴露后4周)断头处死,取出其中的颞骨，在解剖显微镜下打开听泡，蜗尖钻孔及镫骨脱位，2.5%戊二醛固定，在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中漂洗3次，每次10 min，1%锇酸固定1 h,再经磷酸盐缓冲液漂洗、乙醇梯度脱水和干燥，金属镀膜，在扫描电镜下观察耳蜗螺旋器细胞的超微结构变化。

7　统计学处理

所有计量资料数据均以x±s表示，采用SPSS15.0统计软件，组间比较采用完全随机设计资料的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

表1　三组豚鼠不同时间点的体重（g ,±s）Table1 The weight of guinea pigs in 3 groups at different time poin（tg±s）

表1　三组豚鼠不同时间点的体重（g ,±s）Table1 The weight of guinea pigs in 3 groups at different time poin（tg±s）

number Before noise exposrue After noise exposrue 1w after injection 2w after injection 4w after injection group -control group noise exposure group sildenafil group 15 15 15 257.3±2.9 258.4±2.4 257.3±1.7 284.9±1.8 259.4±1.9a258.4±1.9a311.2±1.7 257.2±1.8a272.2±2.1ab337.4±1.6 252.5±2.0a292.3±1.7ab292.3±1.7ab242.3±1.5a313.7±2.0ab

8　结果

8.1一般情况

实验过程中，豚鼠无死亡，未发现中耳感染、行走不稳等迹象。给药后均未出现明显的药物不良反应。实验对照组动物进行相应处理后均逐渐出现饮食量下降,活动减少,体重下降(见Table1)；实验组动物用药四周后，其体重较实验对照组有显著性升高(P<0.05)，但与正常组仍有显著性差异(P<0.05)，余一般情况与正常组未见明显异常。

8.2ABR阈值的改变

对照组豚鼠整个实验期间无明显听觉损伤,噪声暴露组和西地那非组豚鼠均有不同程度的听觉损伤，表现为ABR阈值上移，其中噪声暴露组较为明显，西地那非组较轻（表2）。噪声暴露组给药前、给药1、2、4周后ABR阈值与噪声暴露前相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)；西地那非组给药前、给药1、2、4周后ABR阈值与噪声暴露前比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，给药4周后ABR阈值与给药1、2周后相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。西地那非组与噪声暴露组相比，除噪声暴露结束后这一时间点以外，其余给药后各时间点ABR阈值差异均具有统计学意义(P< 0.05)。在腹腔注射西地那非后第1周，西地那非组ABR阈值已呈下降趋势；而噪声暴露组噪声暴露结束后4周ABR阈值仍呈上升趋势，与给药后第1周相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

8.3Ⅰ波潜伏期的变化

受试豚鼠经不同的方法处理后,发现80dB nHL 下ABRⅠ波潜伏期出现不同程度的改变（表3）：噪声暴露组与西地那非组同对照组相比较，其潜伏期均有所延长，且具有显著性差异(P<0.05)；西地那非组与噪声暴露组相比较，除噪声暴露结束后这一时间点以外，其余用药1、2、4周后Ⅰ波潜伏期均有显著性差异(P<0.05)。

8.4耳蜗毛细胞形态的改变

正常对照组豚鼠耳蜗内、外毛细胞形态正常，排列整齐，界限清楚(图1a、b)。噪声暴露组内毛细胞损伤较轻，3排外毛细胞损伤明显，主要表现为听毛紊乱、融合及缺失(图2a、b)。西地那非组豚鼠耳蜗损伤相对较轻，内、外毛细胞形态结构基本正常，与正常对照动物相比差异不大，外毛细胞听毛仅有轻微倾倒融合现象(图3a、b)。

图1　正常对照组豚鼠耳蜗毛细胞扫描电镜形态纤毛排列整齐，界限清楚Figure 1 The SEM morphology of cochlear in control group Cilia displayed neatly,boundaries clear

图2　噪声暴露组耳蜗毛细胞扫描电镜形态Figure 2 The SEM morphology of cochlear in noise exposure group the inner and outer hair cells displayed mess,fusion and imperfections.

图3　西地那非组豚鼠耳蜗毛细胞扫描电镜形态内、外毛细胞结构基本正常，外毛细胞纤毛仅有轻微倾倒融合Figure3 The SEM morphology of cochlear in sildenafil group the hair cells displayed slight dumping of fusion.

表2　三组豚鼠不同时间点的ABR阈值（dB nHL ,±s）Table 2 The ABR thresholds of guinea pigs in 3 groups at different time points（dB nHL，±s）

表2　三组豚鼠不同时间点的ABR阈值（dB nHL ,±s）Table 2 The ABR thresholds of guinea pigs in 3 groups at different time points（dB nHL，±s）

number Before noise exposrue After noise exposrue 1w after injection 2w after injection 4wafter injection group -control group noise exposure group sildenafil group 15 15 15 23.9±1.3 23.8±1.2 23.3±1.5 24.1±1.2 43.0±1.2a 43.1±1.8a 24.0±1.2 24.0±1.2 42.1±1.2abc 23.5±1.1 50.1±2.1ab 37.8±1.5abc 23.6±1.6 55.8±2.4ab 28.1±1.3abc

表3　三组豚鼠不同时间点的Ⅰ波潜伏期（ms ,±s）Table 3 The PL of waveⅠin different time point in 3 groups（ms，±s）

表3　三组豚鼠不同时间点的Ⅰ波潜伏期（ms ,±s）Table 3 The PL of waveⅠin different time point in 3 groups（ms，±s）

number Before noise exposrue After noise exposrue 1w after injection 2w after injection 4w after injection group -control group noise exposure group sildenafil group 15 15 15 1.27±0.01 1.28±0.02 1.27±0.01 1.28±0.13 1.28±0.13 1.72±0.02a 1.27±0.02 1.85±0.01ab 1.85±0.01ab 1,28±0.02 1.91±0.02ab 1.62±0.02abc 1.28±0.01 1.98±0.02ab 1.53±0.02abc

9　讨论

噪声为频率和强度无规律混合的有害声音，暴露一次短暂强噪声或者长期反复的噪声可导致噪声性听力损失。近年的研究发现，引起噪声性听力损失的原因除机械损伤外，与耳蜗内神经递质不同程度的释放也密切相关。在耳蜗中nNOS定位于外毛细胞、神经节细胞、螺旋韧带、支持细胞。eNOS可表达于内外毛细胞、螺旋韧带的细胞、内皮细胞、螺旋神经节细胞上。环绕耳蜗血管纹毛细血管的内皮细胞是平滑肌样细胞，通过它的收缩功能来调控毛细血管的渗透性和血管直径。研究证明，神经冲动或其他刺激可以促使耳蜗内多种细胞合成NO，外源性的NO可松弛处于收缩状态的内皮细胞，NO又作用于支持细胞和螺旋韧带的血管外皮细胞上的sGC，产生cGMP并进一步作用于cGK-1，以调节支持细胞生理和耳蜗的血液供应[3]。故推测NO通过cGMP发挥作用。而NO/cGMP通路可能是调节耳蜗血供的主要方式[4]。

耳蜗中Hensen's细胞之间有丰富的缝隙连接，此连接实现了细胞间的信号传输和小分子转运[5]，而缝隙连接蛋白主要为Cx26和Cx30，cGMP、三磷酸肌醇、ATP和cAMP等阴离子参与细胞间信号传递、营养、能量代谢及参与K+离子从毛细胞到血管纹边缘细胞之间的的循环都是通过Cx26实现的，循环中断会导致听力损失[5，6]。ATP通过升高Hensen's细胞内的Ca2+浓度来阻断缝隙连接之间的耦联[7]，从而引起耳蜗功能的变化。Matsunobu的研究表明，NO/cGMP途径可以减低在离体状态下由ATP引起的Hensen's细胞内的[Ca2+]升高[8]，从而解除由ATP引起的Hensen's细胞之间缝隙连接通讯的抑制，这无疑有利于维持耳蜗正常的功能。从先前研究推测ATP在内耳中可能是通过Ca2+激活NO/cGMP途径来升高Ca2+浓度[9].由于生理状态下存在于耳蜗中的两种一氧化氮合酶(nNOS ,eNOS )都是Ca2+和钙调蛋白(calmodulin ,CaM)依赖性的，因此可以设想，ATP引起耳蜗中细胞内的Ca2+浓度增加可激活一氧化氮合酶进而激活NO/cGMP途径。二者共同调节耳蜗的生理功能，在耳蜗中存在ATP/Ca2＋－NO/cGMP通路。

观察腹腔内注射西地那非对噪声性聋的影响，发现豚鼠经稳态白噪声连续暴露后,普遍有ABR阈值上移,Ⅰ波潜伏期延长，在给药4周后,噪声暴露组平均阈值仍然高达50dB nHL以上，Ⅰ波平均潜伏期达1.98ms。但西地那非组豚鼠，其ABR阈移的幅度及Ⅰ波潜伏期延长的程度明显低于噪声暴露组,在给药4周后,其ABR阈值已基本接近噪声暴露前水平,Ⅰ波潜伏期也明显低于噪声暴露组。腹腔内注射一定剂量的西地那非,可以降低噪声引起的ABR阈值升高,缩短其引起的Ⅰ波潜伏期延长，扫描电镜结果也反映出西地那非对噪声暴露后的耳蜗毛细胞具有一定的保护作用。另外，经噪声暴露致聋后，豚鼠体重减低，而西地那非组在经药物治疗后体重逐渐增加。推测豚鼠可能因噪声致聋、情绪等因素低落致饮食量下降，体重减轻；经药物治疗后可能因情绪、身体状态改善致体重明显增加，间接体现了西地那非在治疗方面是有效的。

西地那非为一种有效的选择性5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂,能够抑制cGMP降解，进一步影响NO的合成，从而起到扩张血管的作用。有研究发现，耳蜗毛细胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1-PARP（ADP聚合酶）信号肽[2]。PARP1是广泛表达的DNA缺口末端的传感元件，并以NAD+为底物，催化PAR（ADP多聚核糖）到受体蛋白，经DNA断裂并激活PARP，这有利于转录、复制和DNA碱基切除修复[10]。但是，NO的毒副作用又与DNA损伤、PARP过度活化及伴随的因NAD+或ATP耗尽引起的细胞坏死有关[11]。PDE5抑制剂能在增加cGMP信号肽的保护作用同时，而不提高高浓度NO的潜在破坏效应，从某种程度上是因为PRAP可能直接被cGMP激活[12]。PDE5 和Prkg1在OHC中有着非常接近的亚细胞定位，这对OHC中cGMP信号复合物的存在提供了必要的条件。很可能是噪声引起细胞内[Ca2+]增高，从而导致以NO合酶激活为起点的一系列事件的进行，最终引起Prkg1的激活。而Prkg1再通过调节L-型Ca2+通道来抑制[Ca2+]。另外，Prkg1的活化可抑制激素和去极化引起的平滑肌细胞内[Ca2+]的升高，而且可能通过转录因子cAMP应答因子的激活，促进促存活基因的表达[13]，推测PDE5抑制剂对ATP/Ca2＋途径亦有影响。

从本实验结果来看，5-磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂对噪声所致听力损失有一定的逆转，对耳蜗毛细胞噪声性损伤的治疗作用是存在的，推测可能是通过PDE5-cGMP-Prkg1途径调节耳蜗微循环及生理功能的，希望能为噪声性聋的药物治疗提供一点启示和实验依据。另外，曾有个别病例报道服用5磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂可能导致突发性耳聋，考虑可能与使用PDE5抑制剂(包括本品)有时间相关性及服用剂量有关。其中一些患者，可能存在引起耳科相关不良事件的基础疾病或其它因素。由于很多病例的随访信息有限，因此不能确定突发听力减退或丧失是与直接使用本品相关，还是与患者已存在听力丧失的危险因素相关，亦或是因以上两个因素共同作用或存在其它原因[2]。但对于5-磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂如何顺利到达内耳微环境尚需通过实验进一步探讨。

参考文献

1石闯，柳柯，杨仕明，等.宽频带白噪声适度暴露对小鼠听力损害的实验研究[J].中华耳科学杂志,2014,12(2):307-311.Chuang Shi,Ke Liu,Shiming Yang,et al.The experiment research of hearing loss to the wide-band moderately white noise exposure in mice[J].Chinese Journal of Otology,2014,12(2):307-311.

2Jaumann M,Dettling J,Gubelt M,et al.cGMP-Prkg1 signaling and Pde5 inhibition shelter cochlear hair cells and hearing function[J].Nat Med,2012,18(2):252-258.

3Michel o,HESS An，Bloch W,et al.Localization of theNO/cGMP-path⁃way in the cochlea of guinea pigs[J].Hear Res,1999,133(1-2):1-9.

4Matsunobu T,Schacht J.Nitric oxide/cyclic GMP pathway attenuates ATP-evoked intracellular calcium increase in supporting cells of the guinea pig cochlea[J].J Comp Neurol,2000,423(3):452-461.

5王博，胡博华，杨仕明.耳蜗内细胞连接蛋白研究进展[J].中华耳科学杂志,2015,13(1):25-28.Bo Wang,Bohua Hu,Shiming Yang.The reasearch progress of con⁃nection protein in Cochlear cells [J].Chinese Journal of Otology,2015,13(1):25-28.

6张璞，林曦，曲雁.Connexin蛋白与耳聋[J].中华耳科学杂志,2013,11(1):156-159.Pu Zhang ,Xi Lin ,Yan Qu.Connexin protein and deafness [J].Chinese Journal of Otology,2013,11(1):156-159.

7Lagostena L,Ashmore JF,Kachar B,et al.Purinergic control of inter⁃cellular communication between Hensen's cells of the guinea-pig cochlea[J].J Physiol,2001,531(3):693-706.

8Matsunobu T,Schacht J.Nitric oxide/cyclic GMP pathway attenuates ATP-evoked intracellular calcium increase in supporting cells of the guinea pig cochlea[J].J COMPAR NEUBIO,2000,423(2):452-461.

9赵立东,李兴启.耳蜗中的ATP和一氧化氮/环磷酸鸟苷途径.中华耳科学杂志,2003,1(2):65.Lidong Zhao,Xingqi Li.The ATP and NO/cAMP pathway in Cochlear [J].Chinese Journal of Otology,2003,1(2):65.

10 Yu Z,Kuncewicz T,Dubinsky WP,et al.Nitric oxide-dependent nega⁃tive feedback of PARP-1 trans-activation of the inducible nitric-ox⁃ide synthase gene[J].J Biol Chem,2006,281(14):9101-9109.

11Schreiber V,Dantzer F,Ame JC，et al.Poly(ADP-ribose):novel func⁃tions for an old molecule.Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(7):517-528.

12 Sahaboglu A,Tanimoto N,Kaur J,et al.PARP1 gene knock-out in⁃creases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function[J].PLoS ONE,2010,5(11):e15495.

13 Hofmann F,Feil R,Kleppisch T,et al.Function of cGMP-dependent protein kinases as revealed by gene deletion[J].Physiol.Rev,2006,86:1-23.

·基础研究·

Effects of a PDE5 inhibitor on noise-induced hearing loss

LIANG Yuan1,ZHANG Shujun1，ZHANG Xun2，YIN Guiru1，LU Honglue1，WANG Weijie3，FAN Wei4

1Department of Otorhinolaryngology,Affiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde,067000,China; 2 Department of Otorhinolaryngology,Third Hospital of Hebei Medical College,Shijiazhuang,050051,China; 3 County Hospital of Luanping,Chengde,068250,China; 4 Chengde market supervisory authority,Chengde 067000,China

【Abstract】Objective To report effects of sildenafil,a PDE5 inhibitor,on noise-induced hearing loss in guinea pigs.Methods Guinea pigs were randomly divided into a control group,a noise exposure group and a sildenafil treatment group (15 in each group).One week after exposure to white noise at 110 dB SPL,sildenafil (10 mg/kg/d) and NS (4 ml/kg/d) were given to animals in the sildenafil treatment and noise exposure groups,respectively,for 3 weeks.ABR thresholds and the PL of wave I were measured prior to noise exposure,at 1 week post-noise exposure,and at 1,2 and 4 weeks post-drug treatment,Changes of cochlear hair cells were also examined under a scan electron microscope (SEM).Results Shifts in ABR threshold and wave I PL in the sildenafil group were significantly less than in the noise exposure group.SEM showed significant inner and outer hair cells disruption in the noise exposure group,but only slight changes in the sildenafil treatment group that were not significantly different from the control group.Conclusion The inhibitor of PDE5,sildenafil,is able to reduce shifts in ABR threshold and wave I PL in guinea pigs exposed to sound overstimulation,indicating a protective effect against noise-induced hearing loss.

【key words】PDE5; Hearing loss; Cochlea; Hair cells; auditory brainstem response

收稿日期：（2015-10-09审核人：郭维维）

Corresponding author:ZHANG ShujunEmail:liangyuan12388@126.com

通讯作者：张淑君，Email:liangyuan12388@126.com

作者简介：梁媛，硕士研究生，主治医师，研究方向:耳科学

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.022

【中图分类号】R764.433

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-99-5