小型猪动物模型在耳科学领域的应用

杨仕明中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科



小型猪动物模型在耳科学领域的应用

杨仕明
中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科

【摘要】小型猪与人的基因同源性高，各脏器及组织的大小结构和生理学等方面也极其相似，同时具有经济学和伦理学等方面的优势，作为耳科动物模型具有很好的应用前景。本文主要介绍小型猪在耳部解剖、内耳形态及电生理等方面与人的相似性，展示小型猪作为耳科学领域实验动物模型的优势。同时，归纳了目前小型猪动物模型在耳科领域,包括聋病的机制和治疗的相关基础研究、听觉植入相关研究、耳外科解剖教学等方面的应用现状。小型猪作为耳科领域的新兴动物模型将为耳科学及听力学的相关研究，为人类聋病的防治提供最理想的实验模型及论证。

【关键词】小型猪；动物模型；耳科学

Financial funds:This work was supported by grants from the National Basic Research Program of China (973 Program) (# 2012 cb967900),Special Cultivating and Developing Program of Beijing Science and Technology Innovation Base (# Z151100001615050),the Program for Beijing Hundred Talents of Outstanding Science and Technology Academic Leader (# Z151100000315021); Major Project of the "Twelfth Five - year Plan" for Medical Science Development of PLA troops five-year (# BWS14J045) as a key Project of scientific research subject.Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

杨仕明，男，主任医师、教授，博士生导师，博士后导师。国家973项目首席科学家。1988年毕业于第一军医大学军医系，1995年师从姜泗长院士、杨伟炎教授和顾瑞教授，1998年获医学博士学位。现任解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科主任，国家重点学科带头人，全军、北京市及国家教育部重点实验室主任，全军耳鼻咽喉头颈外科专业委员会主任委员，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科分会秘书长，北京医师协会耳鼻咽喉科专家委员会主任委员，北京医师协会耳鼻咽喉专科分会会长。《中华耳科学杂志》和《Journal of Otology》杂志社社长兼总编，Acta Oto-Laryngologica、Chinese Medical Jour⁃nal (Engl)编委，中华耳鼻咽喉头颈外科杂志、中国耳鼻咽喉头颈外科等11家杂志编委。长期致力于攻克耳聋诊治世界难题，建成国内最大的听觉植入中心之一，在耳聋基因治疗、干细胞研究上取得多项突破。主持完成国家863、973等国家军队重大重点课题15项。发表论文305篇，其中SCI论文71篇。累计影响因子185.195分，单篇最高影响因子29.5分（Nature Genetics）。主编参编书著10余部。获国家科技进步二等奖2项、军队及省部级一、二等奖7项。2015年入选「科技北京百名领军人才」和「国家百千万人才工程」，被授予国家「有突出贡献中青年专家」等荣誉称号。享受国务院特殊津贴。

生物医学研究的进展在一定程度上依赖于使用动物模型作为实验和临床假说的试验基础。动物模型是生物医学研究中一个极重要的实验方法和手段，有助于更方便、有效地认识人类疾病发生、发展的规律和研究防治措施。1949年美国荷美尔（Horm⁃el）研究所培育出明尼苏达小型猪[1]，此后，小型猪被广泛地用为生物医学实验中的大动物模型[2,3]以及人造器官的相关研究[4,5]等。传统耳科研究领域的常用动物模型主要是啮齿类动物。这些动物体型较小，易操作，但其内耳体积较小，发育成熟较晚，解剖结构与人类相差甚远，种种原因阻碍了此动物模型在耳科领域的进一步应用[6]。小型猪是实验动物中除灵长类外和人类进化关系最近的物种，与人类在解剖、基因及病理生理学上相似，尤其是内耳各器官的解剖结构与人类很相似，体积相对较大，在形态学、分子生物学研究方面更加直观。因此，小型猪可能成为耳科研究的最理想实验动物，在耳科学领域具有重要的实用价值。本文就小型猪动物模型应用于耳科研究中的优势以及其应用现状进行了系统的综述和分析。

1　小型猪动物模型应用于耳科领域的主要优势

小型猪作为动物模型在生物医学研究中具有广阔的应用前景和重要地位,在人类疾病动物模型、新药安全性有效性评价、异种器官移植供体等领域均显示出独特优势。了解小型猪应用于耳科领域的主要优势，对更好地认识小型猪作为耳科领域动物模型的优越性有重要作用，同时对实验研究选择合适的动物模型具有指导意义。下面就小型猪耳部的解剖学、形态学及电生理等特点进行论述。

1.1小型猪的颞骨解剖结构与人类颞骨非常相似，这是小型猪在耳科领域内广泛应用的基础

Pracy[7]等人为了建立探究中耳炎发病机制的合适动物模型，对猪颞骨进行解剖，与人颞骨结构对比后发现猪中耳内咽鼓管、鼓室、气房系统等主要部分类似于人类。此外，猪的咽部也有类似于人类Wal⁃dayer’s淋巴环的咽淋巴环。因此，Pracy等人认为猪有潜力成为研究人类中耳炎疾病过程中免疫病理变化的理想动物模型。

André Gurr K[8,9]等人按照临床耳外科颞骨解剖流程对羊和猪的颞骨进行解剖，从颞骨外观，外耳道，乳突及中耳等方面与人类颞骨相比较，探讨动物颞骨作为耳鼻喉科教学用标本的适用性。研究表明羊的颞骨比人类小，外耳道较短小，乳突无气化，鼓膜、中耳与人类似，但中耳结构偏小；猪的颞骨外观与人差异较大，外耳道狭长，乳突外形、位置与人类不同，且气化不佳，鼓膜及中耳形态、结构与人极相似，不但有人类的鼓室内结构，而且听骨大小、相对位置与人类似。

伊海金，郭维维[10]等人将10头小型猪的颞骨进行显微解剖，完成了对小型猪的外耳，中耳，内耳及侧隐窝的形态观察和数据测量。发现小型猪颞骨结构中的中耳，内耳及侧隐窝和人类都比较相似。从颞骨外观来看，小型猪的颞骨与人类明显不同，尤其是外耳道、乳突的形态及位置，国外文献认为猪乳突气化差甚至无气化，据本研究观察，其气化程度尚可，类似人类的板障型乳突。小型猪的中耳结构与人类非常类似，其中耳包括鼓室6壁以及鼓室内容物，上、外、内、前壁与人类似，而其下壁为乳突，后壁为半规管，与人类不同。鼓室内听骨、面神经及其分支的位置、毗邻均类似人类。小型猪内耳的鼓室内壁观包括半规管与耳蜗，其耳蜗为3转半，人的耳蜗为2转半。除此不同之处以外，它的耳蜗、前庭及半规管的形态、位置均与人类相似。

经迷路入路对小型猪的脑干耳蜗核的形态、结构及毗邻进行了观察和研究，其外侧隐窝、脉络丛及听面束等神经的形态、位置及毗邻与人类十分相似，并发现其Luschka孔位于绒球、二腹叶和舌咽神经根部围成的三角形内，上界位于第八对脑神经根部，下界位于第九颅神经根部，且有来自第四脑室之脉络丛为标志，与人类类似。通过采用中耳机械力学的研究方法，对小型猪中耳进行数据测量及分析，结果显示:小型猪、普通猪的中耳结构与人类非常相近，而小型猪与普通猪之间的细微差异可能是由于品种不同造成的。

1.2小型猪与人类内耳形态学及电生理的相似性

侯赟、郭维维[11]等人利用火棉胶包埋切片技术及光学显微镜观察小型猪在胚胎21天到胚胎107天的耳蜗发育过程中的形态变化。实验观察到猪耳蜗感觉上皮的分化首先从底圈开始，再到蜗管中部，然后逐渐向顶圈进行，这与人类耳蜗发育及功能的建立具有相似性。猪与人类耳蜗的胚胎时期发育过程相似，出生时耳蜗已发育成熟，而啮齿类动物在出生后耳蜗进一步分化成熟。同时，郭维维、伊海金[12]等人利用光学显微镜及透射电镜观察小型猪耳蜗中阶侧壁形态和功能的发育。研究发现在胚胎第21天（E21）耳蜗管开始形成时，耳蜗中阶的侧壁出现；从E28到E49，侧壁可以根据其沿着耳蜗的位置来区分；在E56，侧壁细胞开始分化为三种不同的类型；在E70，可以清楚地分辨边缘层，中间层和基底层三层细胞；在E91，血管纹和Corti器的形态发育成熟。结果表明，小型猪胚胎期血管纹的发育与Corti器的成熟同步。

Lovell JM[13]等人应用扫描电镜观察猪耳蜗内、外毛细胞的纤毛排列及发育情况。猪的内耳毛细胞与人类相似，在扫描电镜下可以看到一排内毛细胞和三排外毛细胞由底转向顶转螺旋式排列，毛细胞的纤毛在底转明显呈“W”型，顶转因为太长而显得无规则。猪的内毛细胞的静纤毛在顶圈的长度为10-15微米，比中圈及底圈的要长。

任丽丽，郭维维[6,14-15]等人应用耳蜗火棉胶切片及扫描电镜技术观察猪内耳的显微结构形态。发现猪与人类有许多相似之处，主要表现在耳蜗螺旋器和螺旋神经节的结构与人类相似，猪的螺旋器包含毛细胞，柱细胞，Deiters'细胞，Hensen's细胞，Böttcher细胞（人类除外）和内外沟细胞。另外猪的前庭，耳蜗大小和形态与人类很相似：四排毛细胞的排列方式与人类很相似，但顶回毛细胞的静纤毛呈束状排列且较长；前庭毛细胞呈树枝状排列，并且有耳石覆盖。

听力学研究显示猪出生后即有听力，阈值一般在25-30dBSPL，比人类和啮齿类听力阈值略高。人的听力频率范围在20-20KHz,敏感听阈为1kHz；猪的听阈范围比人大一些，可达48KHz水平，敏感听阈大致在2kHz。鼠类属于高频听力动物，听阈高达100kHz以上，相比之下，猪的听阈及敏感听力范围与人类更相似[14-15]。

谢雅芳[16]等人分别在小型猪10日龄、30日龄、60日龄时给予短声（click）和短纯音（toneburst）刺激，并记录相应ABR波形图；通过小型猪与人类听性脑干电位的特性比较发现猪的ABR波形、潜伏期与人极为相似，都可以分化出7个波，但猪以Ⅱ波和Ⅴ波最显著，人以Ⅴ波最显著，啮齿目的动物只能分化出Ⅰ-Ⅴ波。这说明在整个听觉传导通路上，猪与人有相似的神经核团，而鼠有所缺失。人类复杂的内耳及听觉传导通路结构使其潜伏期明显较其他动物更长一些。本实验得出的结果与Strain[17]和Hansen[18]等人的报导基本一致。

任丽丽,郭德强[19]等人采用耳前入路观察正常小型猪的耳蜗内电位的范围。应用钾离子选择性微电极制成的双腔玻璃微电极测得正常荣昌猪耳蜗底回的耳蜗内电位是77.3±14mV，钾离子浓度为147.1±13 mM，比正常人类和啮齿类动物低；首次成功测量并报道小型猪的耳蜗内电位，为今后以小型猪为模型进行耳科疾病的外科治疗及电生理测试奠定基础。

2　小型猪动物模型在耳科领域的应用现状

在生物医学研究领域，动物模型一直占据重要地位，合适的动物模型是决定生物医学实验价值的关键[20]。啮齿类动物是耳科领域常用的实验动物，利用小鼠、大鼠、豚鼠等建立了噪声性聋、内耳老化、分泌性中耳炎、眩晕、耳鸣、膜迷路积水等相关的耳科疾病的动物模型[6]。另外，研究者陆续报道了小型哺乳动物如兔、羊类等作为耳科模型动物[8,21]，但其形态比例均与人耳差别较大。通过对上述研究的综述，发现小型猪的耳部结构、内耳形态及电生理与人类更相似，这些为小型猪动物模型在耳科领域中建立成熟的研究应用体系奠定基础。基于人们对猪与人类在解剖和功能方面相似性的认识。目前，可以进行听力学及外耳、中耳、内耳相关疾病机制及治疗基础研究的动物实验；可以在猪上模拟基因诊断治疗，观察药物治疗效果，模拟人工耳蜗植入，甚至进行听觉中枢重塑机制研究等[22]，应用前景非常广阔。下面就小型猪动物模型在耳科不同领域的应用现状进行论述。

2.1小型猪动物模型在聋病机制和治疗相关的基础实验研究中的应用

陈志婷[23]等应用脉冲式火花噪声仪对正常小型猪进行噪声暴露,首次成功的建立了小型猪噪声性聋动物模型,分析噪声性聋小型猪听功能及内耳形态的特点,填补了大型哺乳动物噪声性聋动物模型的空白。同时，首次尝试应用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs纳米颗粒进行小型猪噪声性聋动物模型的内耳导入研究，为未来大型哺乳动物听功能干预研究提供重要的研究基础。研究发现高强度的脉冲噪声暴露可以造成小型猪感音神经性聋，50次以上的强噪声暴露组，耳蜗中底回内、外毛细胞呈现不同程度的缺失，纤毛融合、散乱，但其耳蜗Corti’s器构架基本正常，并且耳蜗内支持细胞依旧存在，内外毛细胞的传入和传出神经纤维未受到明显损伤。观察到8周后小型猪的听功能及耳蜗损伤无显著恢复，因此噪声性听觉损伤小型猪模型稳定且可靠，是进行在体生物干预，分子内耳递送研究的理想动物模型。

张雪茹，李登科[24]等人将不同浓度ouabain溶液经完整圆窗膜给药，探讨其对贵州小型猪内耳的作用，尝试使用ouabain建立小型猪的听神经病动物模型。通过分析听力改变与药物浓度关系发现ouabain溶液对小型猪螺旋神经节细胞有损伤，并且损伤程度具有浓度依赖性，造成听阈明显提高，但ouabain对毛细胞的影响不明显。目前该实验仍需进一步研究应用ouabain时DPOAE、CM及内耳形态学等指标的变化，从而能够比较成功的建立人类听神经病的小型猪动物模型。

遗传性耳聋在听力损失中占较大比重，由于人类新鲜颞骨标本来源及听力检查方法的限制性,很难将临床上常见遗传性耳聋的发病机制研究清楚。幸运的是,科研团队定位、克隆出一种自发性先天性耳聋猪模型的致病基因。在我国重庆荣昌县有一种虹膜和头部色素缺失的白化猪,听力筛查后证实为双侧重度感音神经性聋,与Waardenburg综合征2A型的特点类似[6],对该疾病的机制和治疗的研究提供了天然的模型[25,26]。通过对这一表型与人类的瓦氏综合症极为相似的耳聋猪动物模型进行听功能、病理形态学、分子生物学以及生理功能等方面的鉴定，并对其致病基因进行了定位、克隆，证明这种白化荣昌猪由于Mitf-M型基因突变,其内耳血管纹中间细胞缺失、毛细胞缺失、蜗管发育异常、螺旋神经节数量减少,导致其耳蜗内电位异常、听性脑干反应电位不能引出。这不仅对研究Waardenburg综合征的发病机制有着重要的意义,对于研究干细胞移植等耳聋治疗措施的途径和方法也具有很大的帮助[27]。

与此同时，通过乙基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitro⁃sourea，ENU）化学诱变小型猪的方法获得白色耳聋突变小型猪，并建立家系。对该家系的表型、听力及内耳形态学等方面进行评估，首次发现Mondini畸形小型猪模型及家系，为Mondini畸形的进一步研究提供了宝贵的动物模型。后期实验将继续寻找致病基因并进行家系遗传验证，利用动物模型分析突变基因的功能、致聋机制。小型猪动物模型将为人遗传性耳聋的致病机理研究、临床治疗及药物筛选等提供重要的生物工具[28]。

马玥莹[27]等尝试通过小型猪腰椎蛛网膜下腔穿刺-脑脊液途径移植干细胞治疗螺旋神经节细胞以及听神经的病变。实验研究发现经蛛网膜下腔注射途径移植人脐带间充质干细胞可以迁移至耳蜗,注射1周内会对其听性脑干反应造成影响,出现ABR波形。对于毛细胞、听神经都有病变的感音神经性耳聋,这种方法可以配合植入人工耳蜗,达到较好的重建听力的效果。

2.2小型猪动物模型在听觉植入研究中的应用

Marc Hoffstetter[29]等人认为猪是评估中耳植入临床前期研究的理想动物模型。猪的中耳与人类类似，在猪中耳进行各种听觉植入实验如人工听骨、振动声桥等有非常重要的意义。

人工耳蜗植入是目前治疗感音神经性耳聋的有效方法，而动物实验是验证新型耳蜗的必要步骤。小型猪耳蜗与人类类似，可以直接应用人类耳蜗电极进行植入实验，是非常合适的人工耳蜗实验动物模型。传统耳蜗动物模型包括猫、豚鼠等，产生的实验数据不能完全反映人类用电极真实情况。本课题组用小型猪模型进行电子耳蜗植入研究，将国产电子耳蜗样机植入10头小型猪耳内，通过植入电子耳蜗后即时和长期的动物实验，观察急性和慢性反应，检验产品的安全性、有效性和稳定性，为临床病人的实际应用奠定基础。同时，初步获得了耳聋猪的听力恢复数据，并发现应用人工电子耳蜗与干细胞联合植入的方法能更好地使耳聋猪恢复听功能。

对于螺旋神经节、听神经以及听觉中枢的病变,即使植入电子耳蜗,也不能完全改善听力，目前临床上对这些病例多采用人工听觉脑干植入的方法进行治疗。国外经迷路ABI植入的手术方法已广泛开展，因为这种方法提供了最直接的进入耳蜗核及相关解剖的路径[30]。但其手术过程相对复杂,成本比人工耳蜗更高,尚未在国内得到普及。小型猪的听觉脑干结构类似于人类，通过在小型猪上模拟进行ABI的过程，可以为临床病人ABI的应用奠定基础。

2.3小型猪动物模型在耳外科手术操作教学中的应用

André Gurr K[8,9]等人认为由于人类颞骨标本缺乏，寻找合适的动物颞骨替代进行解剖训练有重要意义，他们建议耳外科医师可以进行猪颞骨解剖，在猪活体上模拟中耳外科手术，如听骨链手术训练以及耳内技术操作的学习，并可以进行教学训练。

伊海金,郭泓[22]等人通过比较不同动物与人的耳部之间异同，探讨了猪模拟中耳外科操作进行教学训练的可行性以及相关设计。在猪上模拟中耳外科手术操作，可以作为颞骨解剖训练的重要内容，与人类颞骨解剖同步进行，这样既有人类颞骨解剖的操作，又可获取活体动物手术的经验，将极大促进耳外科手术的开展，并可以用于研发新的手术器械以及开展新的外科手术方法。

自19世纪70年代以来，猪作为理想的实验动物模型广泛应用于医药研究领域，一方面是应用猴等高级哺乳动物存在伦理学的限制，另一方面是基于人们对猪与人类在解剖和功能方面相似性的认识[22]。综上所述,小型猪因其在耳部解剖、内耳形态、电生理以及疾病发生机理等方面与人极其相似,目前已逐渐应用于耳科领域,包括聋病的机制和治疗的相关基础研究、听觉植入相关研究、耳外科解剖教学等方面。同时，实验用小型猪的应用数量逐年递增,小型猪有望取代实验猴、犬等成为被大量使用的新型实验动物[31]。由此可见,小型猪作为动物模型在耳科学领域研究中具有广阔的应用前景和重要的地位。

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·听觉研究新模型专辑·

The miniature pig as an animal model in otological research

YANG Siming ,WANG Keshuang
Department of Otolaryngology Surgery,General Hospital of PLA ,Beijing 100853,China Corresponding author:YANG SimingEmail:yangsm301@263.net

【Abstract】The miniature pig genome is highly homologous to that of humans.The reasons for the use of the swine in otological research are its similarities in anatomy and physiology to humans,in addition to the financial and ethical advantages.In this review,we describe the anatomical,morphological,and electrophysiological characteristics of the miniature pig ear.We summarize the uses of the miniature pig in otological research,including deafness research,hearing implant and ear surgery training.The miniature pig is more suitable as an animal model for studying human hearing disorders and has the potential to become a cornerstone in otological and hearing research.

【Key words】miniature pig; animal model; otological research

收稿日期：（2016-01-04）

通讯作者：杨仕明，Email:yangsm301@263.com

作者简介：杨仕明，主任医师、教授、博导、博士后导师，研究方向：耳科学、听觉医学

基金项目：国家973计划重大科学研究计划干细胞项目（2012CB967900）；聋病防治北京市重点实验室科技创新基地培育与发展专项项目（Z151100001615050）;科技北京百名领军人才项目（Z151100000315021）;军队十二五科研课题重点项目（BWS14J045）

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.001

【中图分类号】R764

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-1-5