丙泊酚通过抑制小鼠海马神经元突触释放组织纤溶酶原激活物引起神经毒性损伤

梁超　仓静　薛张纲

(复旦大学附属中山医院麻醉科，上海　200032)



·论著·

丙泊酚通过抑制小鼠海马神经元突触释放组织纤溶酶原激活物引起神经毒性损伤

梁超仓静薛张纲

(复旦大学附属中山医院麻醉科，上海200032)

摘要目的： 明确丙泊酚对体外培养的发育期新生小鼠海马神经元释放组织纤溶酶原激活物(tPA)的影响，并进一步探讨加入外源性tPA能否逆转丙泊酚对发育神经元的毒性损伤作用。方法： 将体外培养的发育期小鼠海马神经元分为4组：对照组(C组)、丙泊酚组(Pro组)、tPA组和丙泊酚+tPA组(Pro+tPA组)。C组不做任何处理；Pro组在培养液中加入丙泊酚，终浓度为5、10、30 μmol/L，继续孵育不同的时间(1 h、2 h、3 h、6 h)；tPA组在培养液中加入tPA，终浓度为1 μmol/L，继续孵育6 h；Pro+tPA组在在培养液中同时加入tPA(终浓度1 μmol/L)及丙泊酚(终浓度10 μmol/L)，继续孵育6 h。检测各组神经元凋亡率及凋亡指标actived-caspase-3蛋白的表达情况。结果： Pro组神经元的凋亡率及actived-caspase-3蛋白的表达水平较C组显著上调(P<0.05)。Pro组tPA水平显著低于C组(P<0.05)。Pro+ tPA组的神经元的凋亡率及actived-caspase-3蛋白的表达水平显著低于Pro组(P<0.05)。结论： 丙泊酚可通过抑制神经元释放tPA而对体外培养的新生小鼠发育期海马神经元产生毒性损伤作用，外源性加入tPA可部分逆转丙泊酚的神经毒性作用。

关键词丙泊酚;发育期神经元;毒性损伤

Propofol Induces Neurotoxicity by Inhibiting tPA Release of Neuronal Synapse in Mouse Hippocampus

LIANGChaoCANGJingXUEZhanggang

DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To explore the effect of propofol on the tPA release of hippocampal neurons in developing mice, so as to investigate whether exogenous tPA could reverse the propofol-induced neurotoxicity on developing neurons.Methods： The hippocampal neurons of developing mice cultured in vitro were divided into 4 groups(n=20 each)：control group(group C)，propofol group(group Pro), group tPA and propofol plus tPA group(group Pro+tPA)．There was no specific treatment in group C. In group Pro，propofol was added to the culture media with the final concentration of 5,10, 30 μmol/L, respectively, and the cells were then incubated for 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, respectively．In group tPA，tPA was added to the culture media with the final concentration of 1 μmol/L，and the cells were then incubated for 6 h．In group Pro+tPA, both propofol and tPA were added to the culture with the final concentration of 10 μmol/L and 1 μmol/L,respectively, and the cells were then incubated for 6 h.The neuron apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein were detected in each group.Results： Compared with that in group C，the apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein in group Pro significantly increased (P<0.05)．The tPA level in group Pro was significantly higher than that in group C(P<0.05). Compared with that in group Pro，the apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein in group Pro+tPA significantly decreased (P<0.05).Conclusions： Propofol induces neurotoxicity on hippocampal neurons of developing mice cultured in vitro by inhibiting neuronal tPA release. And exogenous tPA could partially reverse propofol-induced neurotoxicity.

Key WordsPropofol;Developing neurons;Neurotoxicity

发育期个体暴露于全麻药后所造成的远期神经行为和学习能力损害与全麻药物对发育期神经元产生的毒性损伤作用相关[1-2]。以往的研究发现，丙泊酚对发育期神经元具有促凋亡作用[3]，并会对动物远期的空间学习记忆能力产生负面影响[4]。消除丙泊酚对发育期神经元的毒性损伤作用可能是防治其远期损害的关键，在此前提下，明确丙泊酚对发育期神经元产生毒性损伤的分子机制显得尤为重要。目前已知，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)具有促进神经元外生长和凋亡的双重作用。BDNF在神经接头的囊泡内以前体(proneurotrophin BDNF, proBDNF)形式存在；在proBDNF释放入突触间隙后，其被间隙中的纤溶酶裂解为成熟型BDNF(mature BDNF，mBDNF)；纤溶酶主要由突触前囊泡所释放的组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)裂解纤溶酶原而生成[5]。mBDNF可触发促存活信号通路，加快神经突生长，促进突触的成熟和稳定[6]。而proBDNF激活促凋亡信号通路，抑制轴突生长，诱发生长锥崩溃和细胞凋亡[7]。因此，突触间隙中proBDNF与mBDNF含量的比例在一定程度上决定神经元生长发育的方向。突触中tPA的释放依赖于神经活动[8]，而全身麻醉药物本身可抑制神经活动，但未知全麻药物是否会影响突触tPA的释放。本研究旨在明确丙泊酚对体外培养的发育期新生小鼠海马神经元tPA释放的影响，并且进一步观察加入外源性tPA能否逆转丙泊酚对发育期神经元的毒性损伤作用。

1资料与方法

1.1新生小鼠海马神经元的体外培养取新生BALBc小鼠(由中国科学院神经科学研究所动物实验中心提供)10只，断头取脑，分离海马组织；用胰蛋白酶消化15 min后，加入含血清的培养液(90%DMEM、10%胎牛血清、0.2 mol/LL-谷氨酰胺、100 μg/mL链霉素及100 U/mL青霉素)终止消化，离心后弃上清液；加入含血清培养液并过滤；台盼蓝染色并计数，调整活细胞终浓度为5×104个/mL。将细胞种植于L-多聚赖氨酸包被的96孔板和放有圆形玻片的24孔板中，加入维持培养液[98%Neurobasal培养液(美国Gibco公司)、2%B-27 Supplement(美国Gibco公司)、0.2 mol/LL-谷氨酰胺、100 μg/mL链霉素及100 U/mL青霉素]，于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。

1.2分组及处理将体外培养的新生小鼠海马神经元分为4组：对照组(C组)、丙泊酚组(Pro组)、tPA组和丙泊酚+tPA组(Pro+tPA组)。C组不做任何处理，Pro组在培养液中加入丙泊酚(批号：JR045，意大利AstraZeneca公司)，使丙泊酚终浓度为5、10、30 μmol/L，继续孵育不同的时间(1 h、2 h、3 h、6 h)。tPA组在培养液中加入tPA，tPA终浓度为1 μmol/L，继续孵育6 h。Pro+tPA组在培养液中同时加入tPA(终浓度1 μmol/L)及丙泊酚(终浓度10 μmol/L)，继续孵育6 h。将各组海马神经元接种于6孔培养板，每组6孔，培养至第7天进行实验。

1.3采用流式细胞术检测神经元凋亡情况各组新生小鼠海马神经元培养至第7天时，用胰酶消化，离心，弃上清液，将细胞数调整至(0.5～1.0)×106个/L，采用Annexin V-FITC/PI双标记试剂盒(江苏南京凯基生物科技发展有限公司)进行测定，每个样本收集10 000个细胞荧光信号，用FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)检测神经元凋亡情况，计算凋亡率。

1.4采用Western印迹法检测actived-caspase-3蛋白的表达各组新生小鼠海马神经元培养至第7天时，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。蛋白样品以12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-SAGE)电泳分离，后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用含5%脱脂奶粉的l×TBST(Tris-buffered saline with Tween)稀释actived-caspase-3抗体(稀释度l∶800，美国CST公司)，常温孵育1 h；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(稀释度1∶5000，美国Santa Cruz公司)，常温孵育30 min，曝光成像。以GAPDH为内参。应用Quantity One 5.0软件(美国Bio-Rad公司)进行分析，actived-caspase-3的条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值反映了actived-caspase-3蛋白的表达情况。

1.5采用酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测 tPA按tPA测定试剂盒(美国Gibco公司)说明书操作。

2结果

2.1丙泊酚对体外培养的发育期新生小鼠海马神经元有毒性损伤作用丙泊酚与体外培养的新生小鼠海马神经元共同培养6 h， Pro组神经元凋亡率较对照组显著增加(P<0.05)，Pro组actived-caspase-3蛋白的表达水平较对照组显著上调(P<0.05)。见图1。

与C组比较，*P<0.05图1　与对照组相比较，丙泊酚(10 μmol/L, 6 h)处理显著增加神经元的凋亡率(图A)和actived-caspase-3蛋白的表达水平(图B)

2.2丙泊酚抑制发育期新生小鼠海马神经元释放tPA不同终浓度的丙泊酚(5 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L)与体外培养的新生小鼠海马神经元共同培养6 h，均会抑制海马神经元释放tPA(P<0.05)。丙泊酚(10 μmol/L)与体外培养的新生小鼠海马神经元共同培养不同的时间(0.5 h、1 h、4 h)，均会抑制海马神经元释放tPA(P<0.05)。见图2。

与C组比较，•P<0.05图2　丙泊酚以剂量(图A)和时间(图 B)依赖的方式增加体外培养的新生小鼠海马神经元的tPA水平

2.3加入外源性tPA可部分逆转丙泊酚对发育期小鼠海马神经元产生的毒性损伤作用取体外培养的新生小鼠海马神经元，同时加入丙泊酚(10 μmol/L)和tPA(1 μmol/L)培养6 h后发现，tPA可显著减轻降低丙泊酚所造成的神经毒性损伤作用(P<0.05)。见图3。

与Pro组比较 *P<0.05图3　加入外源性tPA(1 μmol/L)可抑制丙泊酚在新生小鼠海马神经元所诱发的凋亡率增加和actived-caspase-3蛋白的表达水平上调

3讨论

本研究证实，丙泊酚对体外培养的发育期小鼠海马神经元有毒性损伤作用，使海马神经元凋亡率增加、actived-caspase-3蛋白表达水平增加。caspase-3处于凋亡级联反应的下游，它是细胞凋亡过程中的主要效应因子，其活化是凋亡进入不可逆性阶段的标志。因此，actived-caspase-3蛋白表达水平增高与神经元的凋亡密切相关。

既往研究[5]认为，丙泊酚对新生小鼠海马神经元的毒性损伤作用部分是通过激动GABAA受体使L型钙离子通道开放而介导的。最近的研究[8]表明，阻断发育期小鼠神经营养因子受体p75(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)能够抑制丙泊酚所引起的caspase 3表达上调，逆转其对神经生长的抑制作用。p75NTR是神经营养因子的低亲和力受体，主要在神经细胞早期发育过程中丰富表达，它可通过不同的信号转导通路诱导以神经细胞为主的增殖、凋亡、突触建立和神经网络形成。因此，p75NTR有望成为消除(降低)丙泊酚对发育期神经元的毒性损伤作用的有效靶点。然而，有关丙泊酚通过p75NTR抑制神经元生长发育的突触内外分子机制尚不明确[9]，这就使得围绕p75NTR上下游信号分子对丙泊酚神经毒性损伤作用进行系统防治存在一定困难。

由于全麻药物可抑制神经元冲动发放，加之tPA的释放依赖于神经冲动，本研究观察了丙泊酚对体外培养的新生小鼠海马神经元tPA释放的影响。结果表明，丙泊酚可抑制发育期小鼠海马神经元释放tPA。进一步研究发现，加入外源性tPA可部分逆转丙泊酚对发育期海马神经元的毒性损伤。因此，验证了我们的假设：即丙泊酚通过抑制小鼠海马神经元突触tPA释放，进而减少纤溶酶生成，造成proBDNF向mBDNF的转化减少，导致proBDNF-p75NTR信号通路占优势，从而引起神经元毒性损伤及与海马区功能相关的远期学习记忆能力损害。所以，tPA有潜力成为防治丙泊酚对发育期神经元毒性损伤的新的干预靶点。然而，本研究未验证小鼠体内丙泊酚对tPA释放的影响，也未研究加入外源性tPA能否在体内逆转丙泊酚的神经毒性损伤作用，对此尚有待进一步研究。此外，proBDNF-p75NTR信号通路中的其他突触内外信号分子靶点在丙泊酚对发育期神经元毒性损伤中的作用可能是今后的研究方向。

综上所述，丙泊酚可对体外培养的发育期小鼠海马神经元产生毒性损伤作用，丙泊酚可抑制神经元tPA的释放，加入外源性tPA可部分逆转丙泊酚的神经毒性作用。

参考文献

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中图分类号R971+2

文献标志码A

通讯作者梁超，E-mail: superwm226@aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81400930)；上海市卫生和计划生育委员会青年科学基金项目(编号：20144Y0234)；复旦大学附属中山医院青年基金项目(编号：2014ZSQN27)；复旦大学附属中山医院优秀青年计划资助项目(编号：2015ZSYXQN19)