番茄骨干材料对黄化曲叶病毒病抗性的鉴定及防御酶活性差异比较

贺字典，余金咏，沈江杰，毛秀杰，杜艳丽

(河北科技师范学院，河北 秦皇岛，066600)

番茄骨干材料对黄化曲叶病毒病抗性的鉴定及防御酶活性差异比较

贺字典，余金咏，沈江杰，毛秀杰，杜艳丽

(河北科技师范学院，河北 秦皇岛，066600)

为确定番茄对黄化曲叶病毒病的抗性，以番茄骨干育种资源为试验材料，鉴定了34份对番茄黄化曲叶病毒病的抗性，同时测定了8份骨干材料感病前后体内相关防御酶活性的变化。结果表明：44.12%的番茄育种材料属于黄化曲叶病毒病抗性免疫，高抗占11.76%。从34份番茄品种中任选取5份抗病和3份中抗番茄材料进行生化指标的比较，发现8份材料感病后的EST，PAL，POD活性均比感病前高。此外，8份材料的CAT活性感病后均比感病前低。

番茄；黄化曲叶病毒病(TYLCV)；抗病性鉴定；防御酶活性

番茄黄化曲叶病毒病是由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，简称TYLCV)引起的一种重要番茄病害[1]。该病毒的主要传毒介质是烟粉虱，其中B型烟粉虱繁殖快、适应能力强、传毒效率高，是TYLCV的最主要的传播介体[2，3]。烟粉虱的若虫和成虫在刺吸寄主汁液过程中传播TYLCV。在有毒寄主植物上最短的获毒时间为15～30 min，一旦获毒可在体内终生存在，属于持久性传毒类型[4]。烟粉虱的获毒及传毒效率与虫龄及性别有关，雌成虫的传毒效率比雄成虫高5倍左右，成虫传播TYLCV的效率也随虫龄的增长而下降[5，6]。嫁接是传播TYLCV的另一个途径。Pico等[1]1996年报道感病的接穗嫁接到正常的砧木上，TYLCV可以经接穗传至砧木，造成全株系统发病。于力等[7]发现以感病的番茄幼苗为砧木嫁接健康接穗，嫁接后30 d所有接穗的叶片均检测到TYLCV，从另一方面证明嫁接可以传毒。与其它植物病毒不同，TYLCV不经由种子、机械摩擦等途径传毒[8]。近年来烟粉虱的大发生，该病害迅速在全球蔓延，已给美国、以色列、埃及和澳大利亚等国的番茄生产造成严重损失[9]，中国广东、广西、上海、江苏、河南、山东、台湾和浙江等地番茄黄化曲叶病毒病的发生逐年严重，并呈现由南向北迅速蔓延的趋势[10～14]。发病较轻的地块一般减产30%～40%，严重地块造成绝产绝收。

农业生产中解决番茄黄化曲叶病毒病危害的最有效途径是选育抗病品种。不同的植株对同一病原物，同一植株对不同种的病原物可具有不同的抗病性[15，16]，植物抗病性与防御酶类的含量是密切相关的，目前已有关于利用某些防御酶类的含量或活性水平变化作为植物抗病性鉴定的生化指标的研究报道。如PAL活性和酚类物质含量可作为茄子黄萎病抗性鉴定的生化指标[17]；PAL活性可作为花椒叶锈抗性鉴定的生化指标[18]；PPO 和PAL活性作为野生大豆病毒病抗性鉴定的生化指标[19]。但是目前尚未发现关于番茄黄化曲叶病毒病的抗性与相关酶之间关系的研究报道。笔者对34份番茄育种材料对TYLCV抗病性进行鉴定，以揭示番茄对TYLCV的抗性强弱与其防御酶活性的关系，为选育抗病品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验选用的34份番茄品种见表1，由河北科技师范学院番茄育种课题组提供。

1.2 抗病性鉴定

1.2.1 调查方法 大棚内番茄黄化曲叶病毒病是在自然条件下发病的，无人为干预，待大棚内番茄普遍发病，病情稳定，病害特征明显后，调查棚内番茄各株的发病情况，每7 d调查1次，计算病株率和病情指数。

1.2.2 番茄黄化曲叶病病情指数的分级标准

0级：整株健康无黄化曲叶。

1级：轻度矮化。株高为健株株高的4/5左右，顶部1～2枝枝条黄化曲叶，结果期有3穗以上果实。

2级：矮化。株高为健株株高的2/3左右，顶部典型黄化曲叶，结果期下部有2穗果。

3级：明显矮化。株高为健株株高的1/2左右，顶部典型黄化曲叶，结果期下部有1穗果。

4级：严重矮化。株高为健株株高的1/3以下，整株典型症状，结果期无番茄果实，或提早枯死。

1.2.3 病株率和病情指数的计算

发病率=(病株数/总株数)×100%

1.2.4 番茄病毒病群体抗性分级标准 参考文献[20]的抗性鉴定标准。其中免疫I(病情指数为0)，高抗HR(2≥病情指数>0)，抗病R(15≥病情指数>2)，中抗MR(30≥病情指数>15)，感病S(100≥病情指数>30)；并将免疫、高抗、抗病、中抗均归为抗病。

1.3 试验材料的采集

从34份番茄育种材料中选取抗病和中抗的8份番茄育种材料，分别为1-浙粉702和迪福，4-216，3-16绿，5-16绿选小脐，8-yzfgcg，6-jl-1×815♂不易落，7-JdftF2和2-寒光，每个品种采集未感染黄化曲叶病毒和感染番茄TYLCV植株叶片各3株。将采摘下的番茄叶片立即放入冰盒中，带回实验室，放入-20 ℃冰箱内保存，备用。

1.4 酶粗提液制备

将3棵番茄叶片混合，随机称取各处理冰冻叶片1 g，3次重复。然后将3 mL的0.01 mmol/L磷酸缓冲液( pH 6.5，内含PVP 10 g/L，疏基乙醇15 mmol/L)分2次加入，冰浴研磨过滤后，15 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清液为酶粗提液。

1.5 防御酶活性测定

1.5.1 酯酶( EST )活性测定 采用贾显禄[21]的方法测定。

1.5.2 过氧化物酶( POD ) 活性测定 采用愈创木酚法[22]，以每分钟OD450值改变0.1的酶用量为一个酶活单位。

1.5.3 超氧化物歧化酶( SOD )活性测定 采用Giannopolitis和Rice方法测定[23]，以每分钟抑制氮蓝四唑(NBT)50%的酶用量为一个酶活单位。

1.5.4 苯丙氨酸解氨酶( PAL) 活性测定 采用陈捷等[24]的方法，以每分钟OD290值改变0.01的酶用量为一个酶活单位。

1.5.5 蛋白质含量测定 采用考马斯亮兰G250法[ 25]。酶的比活性以每毫克蛋白所含的酶单位数(U/mg protein)。

1.5.6 过氧化氢酶(CAT)活性测定 参考陈捷等[24]测定。以每分钟OD值减少0.01的酶用量为一个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 番茄对TYLCV抗病性鉴定

番茄育种材料抗TYLCV抗病性差异较大，表现免疫的有15份，占供试材料总数的44.12%;表现高抗的有4份，占11.76%；表现抗病的有10份，占29.41%；表现中抗的有5份，占14.71%(表1)。

2.2 番茄感染TYLCV前后EST活性的变化

番茄叶片内的EST活性测定结果表明，受TYLCV侵染的8份番茄育种材料EST活性均比未感染TYLCV时的高(图1)。其中2-寒光感病后叶片内EST活性是未发病时的1.46倍； 7-jdftf2和8-yzhgcg感病后EST活性分别是未发病时的1.9倍和1.8倍；而其余育种材料感病前后EST活性差异不显著。

2.3 番茄感染TYLCV前后CAT活性的变化

番茄叶片内的CAT活性测定结果表明，受黄化曲叶病毒侵染的8份番茄育种材料CAT活性均比未感染黄化曲叶病毒的降低(图2)。1-浙粉702和迪福未发病叶片内CAT活性分别是感病状态下的3.60倍；3-16绿和7-jdftf2未发病时CAT活性分别是发病后的1.85倍和2.07倍；其余育种材料感病前后差异不显著。

2.4 番茄感染TYLCV前后PAL活性的变化

番茄叶片内的PAL活性测定结果表明，受黄化曲叶病毒侵染的8份不同番茄育种材料PAL活性均比未感染黄化曲叶病毒的高(图3)。其中2-寒光，3-16绿，5-16绿选小脐，6-jl-1×185(不易落)和8-yzhgcg发病后叶片内的PAL活性分别是未发病的1.99，1.23，1.47，1.30和1.11倍。

2.5 番茄感染TYLCV前后蛋白质含量活性的变化

番茄叶片内的蛋白质含量测定结果表明，除2-寒光外，受黄化曲叶病毒侵染的7份番茄育种材料蛋白质含量均比未感染黄化曲叶病毒的低(图4)。其中1-浙粉702和迪福、3-16绿育种材料未发病叶片内蛋白质含量分别是感病状态下的1.66倍，1.59倍。4-216，6-jl-1×185(不易落)和8-yzhgcg育种材料感病前蛋白质含量是感病状态下的1.29倍，1.46倍和1.53倍。

图1 不同番茄品种感病前后EST活性变化注：图中的品种序号1，代表1-浙粉702和迪福；2，代表2-寒光；3，代表3-16绿；4，代表4-216；5，代表5-16绿选小脐；6，代表6-jl-1×815(不易落♂)；7代表7-jdftf2；8代表8-yzhgcg。以下同。

图2 不同番茄品种感病前后CAT活性变化

图3 不同番茄品种感病前后PAL活性的变化 图4 不同番茄品种感病前后蛋白质质量分数的变化

2.6 番茄感染TYLCV前后POD活性的变化

番茄叶片内的POD活性测定结果表明，受黄化曲叶病毒侵染的8份番茄育种材料POD活性均比未感染黄化曲叶病毒时的高(图5)。3-16绿发病后叶片内POD活性分别是未发病时的3倍；其余育种材料感病前后POD活性差异不显著。

图5 不同番茄品种感病前后POD活性的变化

图6 不同番茄品种感病前后SOD活性的变化注：1表示jl-1×815(不易落♂)，2表示7-jdftf2，3表示 3-16绿，4表示4-216

2.7 番茄感染TYLCV前后SOD活性的变化

番茄叶片内的SOD活性测定结果表明，除7-jdftf2育种材料以外，其余番茄育种材料受黄化曲叶病毒侵染后叶片内的SOD活性均比未感染黄化曲叶病毒的低(图6)。

3 结论与讨论

目前，番茄种质资源缺乏，特别是抗病、抗逆的资源材料。我国抗病品种主要靠从国外引进的亲本改造和国外抗病品种后代分离筛选获得，自主创新材料较少。赵丽萍等[26]利用从国外和台湾地区引进的抗性父母亲本育成的苏粉红1号就对TYLCD田间抗性较强，适宜在TYLCD严重发生的地区种植，说明父母本对TYLCD抗性强弱决定了后代的抗性。

在植物的抗病反应中，其中一些相关酶类起着很重要的调控作用，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等，植物病害的发生与这些酶活性变化有着密切的关系，并且抗病反应和感病反应两者在SOD等酶活性变化方面有着显著的不同[27～29]。PAL活性是番茄对根霉果腐病抗性的参考指标[30]。番茄叶片苯丙氨酸解氨酶( PAL)、 多酚氧化酶( PPO)、过氧化物酶( POD)、脂氧合酶( LOX)、几丁质酶和β- 1，3葡聚糖酶活性明显增强后可抵抗番茄灰霉病侵染[31]。但目前尚未发现关于番茄黄化曲叶病毒病抗性高低与相关酶活性的研究报道，本实验通过分别比较了8份不同番茄育种材料发病前后几种相关酶活性水平的变化，发现 8份材料感病后的EST，PAL，POD活性均比感病前高，而CAT活性感病后均比感病前低。所得结果结合分子生物学如SSR标记、RFLP标记和蛋白质组学进一步研究后，对于指导番茄抗TYLCD育种会更有意义。

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(责任编辑：朱宝昌)

Resistance Identification of Tomato Key Materials to Yellow Leaf Curl Virus and Comparison of Major Defensive Enzymes Activities Between Healthy and Sick Breeds

HE Zidian, YU Jinyong, SHEN Jiangjie, MAO Xiujie, DU Yanli

(Hebei Normal University Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600，China)

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) has developed from south to north in recent years and become a major tomato disease in Eastern Hebei. The resistance of 34 main tomato breeding materials to TYLCV was identified in the greenhouse. At the same time, the defensive enzyme activities of 8 key materials signed resistant and susceptible were tested between healthy and sick ones. The results showed that 44.12% were immune, 11.76% were high resistant to TYLCV. With the comparison of differences test, the activities of EST, PAL and POD in pathogenic materials were higher than that of healthy ones, while CAT activity seemed to be opposite.

tomato; yellow leaf curl virus (TYLCV); resistance identification; defensive enzyme activity

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.02.006

2016-03-09; 修改稿收到日期: 2016-03-30

S436.412.1+1

A

1672-7983(2016)02-0027-06

贺字典(1972-)，女，博士，教授。主要研究方向：蔬菜病害生物防治。