秦皇岛地区狐源致病性E.coli对四环素类药物耐药性和耐药基因的检测

张召兴，李蕴玉，贾青辉，张香斋，张艳英，耿田田，李佩国

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

秦皇岛地区狐源致病性E.coli对四环素类药物耐药性和耐药基因的检测

张召兴，李蕴玉，贾青辉，张香斋，张艳英，耿田田，李佩国*

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

为了确定秦皇岛地区狐源大肠杆菌(E.coli)对四环素类药物的耐药性和耐药基因分布，采用常规的鉴定方法，从不同养狐场送检的腹泻的狐狸体内分离鉴定出20株E.coli。致病性试验表明，该菌为致病性E.coli。药敏试验结果表明：分离菌株对四环素和强力霉素药率分别达到95%和90%。通过PCR方法检测分离菌株四环素类药物的耐药基因，结果显示，tetA和tetB基因的检出率分别为100%和95%。本研究为秦皇岛地区防治狐源致病性大肠杆菌病提供实验基础。

狐狸；E.coli；四环素；PCR；耐药基因；秦皇岛地区

大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)引起的一类疾病的总称[1]。E.coli是一种人畜共患细菌，可以引起人及不同动物发病[2]。该菌可以引起不同动物腹泻、肠炎、甚至脱水而死，也可以引起其他的器官感染[3]。相关的报道E.coli携带致病性毒力岛，能引起水貂腹泻，且呈急性死亡[4]。E.coli对四环素类药物有强的耐药性，主动外排和核糖体保护作用是四环素产生耐药的机制[5]。

笔者通过对秦皇岛地区狐源E.coli分离鉴定，探索该菌对四环素类药物的耐药性和耐药基因机制的携带情况。从分子生物学角度分析秦皇岛地区狐源E.coli对四环素类药物产生耐药的原因，为秦皇岛地区狐源E.coli防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

秦皇岛地区不同养殖场送检的腹泻的狐狸，采集肝、心等组织分离培养。

1.2 试剂及仪器

ID32E肠道菌鉴定试剂条由法国梅里埃(bioMerieuxsa)公司生产；DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix，Gold View核酸染液和树脂型TM基因组DNA提取试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司；常规试剂由本实验室提供。

1.3 实验动物

约20 g健康BALB/c小白鼠84只，引自北京维通利华实验动物有限公司。

1.4 细菌分离纯化

无菌采集肝脏划线接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基，37 ℃恒温培养12～24 h。在普通琼脂培养基进行纯化培养。

1.5 细菌形态特征

无菌挑取上述纯化培养菌，经革兰氏染色镜检。

1.6 细菌生化特性鉴定

用ID32E肠道菌鉴定试剂条和自动ATB生化仪进行生化试验。

1.7 致病性试验

将实验小鼠分为试验组与空白对照组，每组4只。试验组每只小鼠0.2 mL(109CFU/mL)腹腔注射；空白对照组每只小鼠注射等量生理盐水。观察发病及死亡情况，分离细菌并鉴定。

1.8 药敏试验

按照美国临床检验标准委员会推荐的标准K-B纸片法进行试验和结果判断[6]。

1.9 引物设计

参考相关文献[7]，并设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR扩增引物序列

1.10 细菌DNA模板提取

按树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书操作，存于-20 ℃备用。

1.11 耐药基因PCR检测

PCR扩增反应体系(25μL)：模板DNA，2 μL；上下游引物，各0.5 μL；2×Taq Marker Mix，12.5 μL；ddH2O，9.5 μL。

反应条件：94 ℃预变性，5 min；94 ℃变性，50 s；退火(见表1)，50 s；72 ℃延伸，50 s；72 ℃终延伸，10 min。共30个循环。

扩增产物取出5 μL电泳检测。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化与形态观察

麦康凯琼脂培养基上长出具有粉红色、边缘光滑整齐、湿润的扁圆的菌落；伊红美兰培养基上长出深紫黑色、带金属光泽的圆形菌落。在普通琼脂平板上，形成白色、光滑湿润的菌落。染色镜检，两端钝圆，呈杆状的革兰氏阴性杆菌(图1)。

图1 革兰氏染色阴性(10×100)

2.2 生化试验结果

20株分离菌株均能发酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖,产酸不产气，不分解尿素。菌株不利用蔗糖，吲哚试验为阳性，用ATB全自动生化鉴定系统进行检测分析，鉴定结果为E.coli，评定结果合格率为99.9%。

2.3 致病性试验

试验组小鼠大约24 h全部发病死亡，分离培养鉴定。结果显示所分离菌与该病原菌一致。对照组4只小白鼠健康存活，表明该菌有一定致病性。

2.4 药敏试验

20株狐源E.coli对四环素类药物中的四环素、强力霉素两种药物均耐药，对四环素的耐药率为95%，对强力霉素耐药性为90%(表2)。

2.5 耐药基因PCR检测结果

该菌对tetA基因检出率100%(图1)；tetB基因检出率95%(图2)；该菌对株tetA和tetB同时检出率为95%。

表2 20株狐源E.coli对四环素类的药物的耐药结果(n=20)

注：S，高度敏感；I，中度敏感；R，耐药。

图1 PCR结果(tetA基因)

图2 PCR结果(tetB基因)

3 结论与讨论

在秦皇岛地区不同的养狐场分离的20株病原菌，对其分离菌从形态特征观察、培养特性分析、生化鉴定等多方面鉴定，确定为E.coli，与《伯杰细菌鉴定手册》中报道的E.coli的特性一致[8]。通过致病性试验，该菌有一定致病性。证实该地区分离的20株狐源E.coli均为致病性E.coli，该菌是引起不同日龄狐狸腹泻的主要病原菌。

本次试验对从腹泻狐狸体内分离的20株致病性大肠杆菌，对四环素类药物中常用的四环素、强力霉素进行了药敏试验，结果表明：20株致病性大肠杆菌对两种药有很强的耐药性。四环素类的药物是常用的广谱抗生素，被广泛用于动物的治疗及细菌性疾病的预防。主要的抗菌机理为阻止氨酰tRNA与核糖体的结合位点的结合来阻止细菌蛋白质的合成[5]。其主要的耐药机制为：主动外排作用、核糖体保护作用、产生灭活四环素的酶以及一种未名机制，通常认为主动外排和核糖体保护作用是四环素产生耐药的机制，以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌就是以主动外排为主[9]。对于狐源致病性大肠杆菌对四环素类的药物耐药的研究报道很少，对四环素产生很强的耐药性，可能与致病性大肠杆菌本身对该类药物的耐药机制有关。

tetA和tetB是四环素主要耐药基因。该试验对秦皇岛地区的狐源E.coli对四环素类药物tetA和tetB基因进行了检测，试验表明了该菌携带tetA和tetB基因100%和95%。多重耐药性达95%。Bryan等对人及动物体内分离的E.coli通过对四环素类药物的tetA和tetB耐药基因分析具有很高的检出率[9]。相关报道四环素耐药基因tetA和tetB对猪源E.coli携带率为27%和59%[10]。该试验结果与报道的四环素类药物的耐药基因的检测分析基本一致。秦皇岛地区狐源E.coli对四环素类药物产生很强的耐药性，除了对四环素类药物的不合理或高剂量的使用之外，也可能是接合质粒上耐药基因发生转移导致该菌产生耐药性[5]。对四环素类药物的耐药机制再做进一步研究提供基础。

[1] 陈薄言.兽医传染病学[M].第5版.北京:中国农业出版社,2006.

[2] 费恩格,李德昌,丁壮.动物疫病学[M].北京:中国农业出版社,2004.

[3] 房海,陈翠珍,张晓君.肠杆菌科病原细菌[M].北京:中国农业科学技术出版社,2011.

[4] 史秋梅,张艳英,房海,等.腹泻水貂检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌[J].中国兽医学报, 2012,32(6):857-861.

[5] Roberts M C.Update on acquired tetracycline resistance genes[J].FEMS Microbiology Letters,2005,245(2):195-203.

[6] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s: approved standard, seconded[J].NCCLS document M31-A2 Wayne USA,2000,49(21)105-126.

[7] 牛建宁,崔恩慧,唐攀,等.鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因检测[J].西北农业学报,2014,23(11):35-39.

[8] R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].第8版.北京:科学出版社,1984.

[9] 牛建宁.鸡源大肠杆菌的分离鉴定及四环素类耐药基因检测研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2014.

[10] Bryan A,Shapir N,Sadowsky M J.Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse, nonselected, and nonclinicalEscherichiacolistrains isolated from diverse human and animal sources[J].Appl Environ Microbiol,2004,70(4):2 503-2 507.

[11] Kozak G K,Boerlin P,Janecko N,et al.Antimicrobial resistance inEscherichiacoliisolates from swine and wild small mammals in the Proximity of swine farms and in natural environments in Ontario,Canada[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(3): 559-566.

(责任编辑：朱宝昌，陈于和)

Resistance of PathogenicE.coliIsolated from Qinhuangdao Foxes to Tetracycline Antibiotics and Detection of Resistance Genes

ZHANG Zhaoxing, LI Yunyu, JIA Qinghui, ZHANG Xiangzhai, ZHANG Yanying,GENG Tiantian, LI Peiguo

(Hebei Normal University of Science & Technology, Hebei Province Key Laboratory of Veterinary Preventive Medicine, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

In order to understand the resistance of pathogenicE.colioriginated from the foxes in Qinhuangdao area to tetracycline antibiotics and distribution of resistance genes, twentyE.colistrains were isolated and identified from inspection diarrhea fox body in different fox farms. The results showed that all the isolated strains expressed pathogenically. The drug sensitivity test indicated that the isolated strains were highly resistant to tetracycline and doxycycline. The detection rate of drug resistance to tetracycline and doxycycline might reach 95% and 90%, respectively. PCR detection implied the detection rates of tetracycline resistance genestetA andtetB were as high as 100% and 95%, respectively. The research would provide an experimental basis for the prevention and treatment of the fox-derived pathogenicE.coliin Qinhuangdao area.

fox;E.Coli;tetracycline;PCR;resistance gene;Qinhuangdao area

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.02.010

秦皇岛市农业科学研究院项目(项目编号：2014-04)。

2016-05-11; 修改稿收到日期: 2016-06-13

S852.61+2

A

1672-7983(2016)02-0055-04

张召兴 (1988-)，男，在读硕士研究生。主要研究方向：兽医微生物学与免疫学。

*通讯作者，男，教授，博士。主要研究方向：动物疫病防控技术。E-mail: lpeiguo@163.com。