荧光可激活型超小粒径金纳米棒分子探针在乳腺癌细胞诊疗一体化中的研究

荧光可激活型超小粒径金纳米棒分子探针在乳腺癌细胞诊疗一体化中的研究

赵飞翔李江王凌玮武明豪张雪宁

300211天津医科大学第二医院放射科

目的制备超小粒径金纳米棒（UGNRs）与荧光素相结合的荧光信号可激活诊疗一体化多功能分子探针，并评估其对肿瘤细胞的光热治疗效果。方法采用一步法合成UGNRs，使用巯基乙胺对其进行修饰，利用巯基乙胺的—NH2与羧基化荧光素Cy5的—COOH进行酰胺缩合将两者相连，构建荧光信号可激活的超小粒径金纳米棒（AUGNRs）。使用乳腺癌4T1细胞研究其细胞摄取能力和谷胱甘肽介导成像能力，并应用808 nm激发光照射与AUGNRs共培养的4T1细胞，噻唑蓝（MTT）比色法及钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）染色法观察其光热治疗效果。结果成功制备了AUGNRs，其可被4T1细胞快速、高效地摄取，并可产生Cy5荧光信号；其与4T1细胞共培养无明显细胞毒性，在808 nm激光照射下可产生明显的光热效果，有效杀死4T1细胞。结论AUGNRs具有荧光可激活性，并可产生显著的光热效果有效杀伤肿瘤细胞。

超小粒径金纳米棒；光热治疗；荧光；谷胱甘肽

Fund program:Natural Science Foundation of Tianjin,China(13JCYBJC23800);Science and Technology Fund of Tianjin Municipal Health Bureau(2014KZ108)

0 引言

光热治疗是近年来兴起的一种温和、高效、不良反应小的非侵入性肿瘤治疗方法[1]。其主要机制是将光能转化为热能，升高肿瘤部位温度，利用正常组织和肿瘤细胞对温度耐受的差异，达到既使肿瘤细胞凋亡又不损伤正常组织的目的[2]。金纳米棒（gold nanorods，GNRs）具有表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）性质，增大其长轴与短轴的比值，可使GNRs在600～900 nm产生强烈的纵向吸收峰（localized surface plasmon resonance，LSPR），进而可将近红外光（near-infrared，NIR）高效地转换为热能，在短时间内快速提高照射部位的温度，达到杀伤肿瘤细胞的效果[3]。最新研究结果表明，GNRs的短轴＜10 nm时，具有更高的光热转换效率[4]，同时能有效降低NIR的照射剂量，进一步降低治疗的不良反应。

为了实现GNRs在肿瘤治疗中的特异性可视化成像，本研究设计了以超小粒径金棒纳米（ultrasmall goldnanorods，UGNRs）为模板[5]、谷胱甘肽（glutathione，GSH）[6]为激活剂介导荧光信号释放、诊疗一体化多功能分子探针——可激活的超小粒径金纳米棒（activatable ultrasmall gold nanorods，AUGNRs），并研究其体外诊疗效果。Cy5与UGNRs连结后，由于荧光共振能量转移效应，Cy5的荧光信号被淬灭；而肿瘤细胞内高浓度的GSH可特异性置换AUGNRs表面的巯基乙胺-Cy5，当Cy5与UGNRs分离后，荧光共振能量转移效应消失，Cy5的荧光信号恢复，从而实现荧光信号“关闭-开放”的可激活性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

盐酸、硝酸银、抗坏血酸、氯金酸、硼氢化钠、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）、巯基乙胺、噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、钙黄绿素-AM（Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Sigma-Aldrich公司），荧光染料Cy5（上海安格利药物科技）。小鼠乳腺癌细胞系4T1（天津医科大学第二医院分子影像实验室冻存）。

JEOL-2010F透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）（日本JEOL公司），紫外-可见分光光度计（美国PerkinElmer公司），Zeta电位/水合粒径检测仪（英国Worcestershire公司），Maestro EX小动物荧光成像仪（美国CRI Maestro公司），Thermo Varioskan Flash 3001酶标仪（芬兰Thermo Fisher Scientific公司），808 nm激光发射器（中国长春电子光学科技有限公司），IX70-141荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 UGNRs的制备

UGNRs的合成参照文献[7]。将10 ml CTAB溶液（浓度为0.2 mol/L）与10 ml氯金酸溶液（1 mmol/L）混合，置于30℃水浴中温和搅拌；随后，依次加入580 μl硝酸银（4 mmol/L）、48 μl盐酸、140 μl抗坏血酸（0.1 mol/L）；待溶液由金黄色变为无色后，加入30 μl硼氢化钠溶液（0.01 mol/L），快速搅拌30 s；30℃水浴中静置6 h后以12 000×g离心15 min，去除上清液即得UGNRs。

1.2.2 AUGNRs的制备

将以上得到的UGNRs溶解于8 ml去离子水中，加入0.1 ml质量浓度为1 mg/ml的巯基乙胺溶液，室温搅拌3 h；随后以12 000×g离心15 min，去除上清液，并用10 ml去离子水洗涤3次，去除被巯基乙胺置换下的CTAB和游离的巯基乙胺；再向巯基乙胺-UGNRs溶液中加入0.8 ml质量浓度为1 μg/ml的Cy5-COOH溶液，室温搅拌3 h，12 000×g离心15 min，去除上清液，并用10 ml去离子水洗涤3次，最终得到AUGNRs。

1.2.3 AUGNRs的表征

纳米粒子（约2 mg）在测量前用去离子水重悬并超声。AUGNRs的平均粒径、粒径分布和Zeta电位均通过Zeta电位/水合粒径检测仪测量，每项各测定3次。紫外吸收光谱通过紫外-可见分光光度计测量。纳米粒子的形态通过TEM观察。

1.2.4 AUGNRs的荧光释放

将等量UGNRs、AUGNRs、游离的Cy5溶液、AUGNRs与GSH混合液分别加入1.5 ml的离心管中，置于小动物荧光成像仪中于640 nm激发光下成像，随后通过荧光分光光度计测定640 nm激发光下各溶液的荧光发射信号及强度。同时，取质量浓度为400 μg/ml的AUGNRs 0.2 ml于96孔板中，分别加入10 mmol/L的GSH和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），使用多功能酶标仪连续监测4 h内640 nm激发光下各孔中溶液的荧光强度。

1.2.5 AUGNRs的生物相容性检测

4T1细胞用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和质量浓度为100 mg/ml链霉素的1640培养基，于5%CO2、37℃的环境下培养。采用MTT比色法检测AUGNRs的细胞毒性。将4T1细胞按8 000/孔的密度接种到96孔板中，培养24 h。分别加入不同质量浓度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/ml）的AUGNRs共培养24 h，对照组加入等体积的PBS；随后吸去悬液，加入MTT质量浓度为5 mg/ml的细胞培养液继续孵育4 h；吸去悬液，加入120 μl二甲基亚砜，37℃下温和振荡15 min，使用多功能酶标仪测定490 nm处的吸光度（A）值。以对照组的A值为100%，计算加入不同质量浓度AUGNRs后的细胞存活率。

1.2.6 AUGNRs的光热转换效果

量取0.8 ml不同质量浓度（12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml）的AUGNRs，使用808 nm激光发射器，以1.5 W/cm2的功率照射5 min，每30秒测1次实时温度（PBS为对照组）。随后，取照射后的AUGNRs溶液测其紫外-可见-近红外吸收光谱。

1.2.7 细胞摄取

将4T1细胞按40 000/孔的密度接种到24孔板中，培养24 h；吸去悬液，加入无血清1640培养液孵育2 h；随后分别加入质量浓度均为400 μg/ml的UGNRs和AUGNRs，PBS为对照组，孵育2 h；吸去悬液，用PBS洗涤细胞3次，加入质量浓度为0.1 mg/ml的DAPI溶液，室温避光孵育30 min，使用荧光显微镜观察细胞。

1.2.8 AUGNRs的细胞光热实验

将4T1细胞按8 000/孔的密度接种到96孔板中，培养24 h；分别加入不同质量浓度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/ml）的AUGNRs共培养24 h，对照组加入等体积的PBS；随后吸去悬液，加入200 μl细胞培养液，用808 nm的NIR激发光以1.5 W/cm2的功率照射5 min，使用1.2.5节所述的MTT比色法检测细胞存活率；最后用Calcein-AM/PI对4T1细胞进行双染色，于荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（x±s）表示，组间数据比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 AUGNRs的制备与表征

采用一步法制备得到CTAB包覆的UGNRs。利用巯基与金表面可高效形成S—Au键的特性，使用巯基乙胺置换UGNRs表面的CTAB，随后巯基乙胺包覆的UGNRs与羧基化的荧光染料Cy5通过氨基与羧基缩合形成酰胺键相连，制备得到AUGNRs。由TEM图（图1A）可见，UGNRs呈棒状结构，尺寸分布相对均一且分散性良好。通过TEM软件估测UGNRs的纵向平均长度约18 nm，横向平均宽度约4 nm，即长径比约为4.5。图1B为AUGNRs的紫外-可见-近红外吸收光谱，AUGNRs在520 nm处有1个较低的横向吸收峰，在810 nm处有1个更高的LSPR，这表明AUGNRs可吸收810 nm附近的NIR光。图1C显示通过动态光散射所测AUGNRs的水合粒径为（14.7±2.7）nm，这有利于细胞对其摄取。由图1D可知，CTAB-UGNRs、巯基乙胺-UGNRs和AUGNRs的Zeta电位分别为（34.19±1.81）、（14.84± 1.00）、（10.12±1.15）mV。其中CTAB带强正电荷，巯基乙胺带弱正电荷，巯基乙胺-UGNRs的Zeta电位较CTAB-UGNRs降低，说明UGNRs表面的CTAB被巯基乙胺所置换；而AUGNRs的Zeta电位较巯基乙胺-UGNRs降低则表明Cy5-COOH与巯基乙胺所带的—NH2缩合形成酰胺键。

图1 AUGNRs的表征

2.2 GSH介导AUGNRs的荧光复性

有文献报道，正常组织细胞中GSH的浓度为0.005 mmol/L，而在多数肿瘤细胞中，GSH的浓度可显著升高至2～10 mmol/L[8]；GSH可特异、高效地降解S—Au键，当S—Au键被降解以后，巯基乙胺-Cy5与GNRs分离，GNRs对Cy5的淬灭效应消失，使Cy5的荧光得以恢复。以上两点为实现AUGNRs内Cy5荧光信号“淬灭-恢复”的转变提供了可能[9]。如图2A所示，使用小动物荧光成像仪对UGNRs、AUGNRs、游离Cy5、AUGNRs与10 mmol/L GSH的混合液进行成像，仅有AUGNRs与GSH的混合液和游离的Cy5可检测到荧光信号。随后使用荧光分光光度计进行测量，结果显示AUGNRs在无GSH存在的情况下，荧光强度几乎为0；而当AUGNRs与10 mmol/L的GSH溶液混合时，荧光强度显著升高，且荧光信号的波长与游离Cy5的波长均为645 nm。上述结果表明，GSH可高效恢复AUGNRs中Cy5的荧光，这为实现荧光介导肿瘤的可视化治疗提供了可能。图2B所示为连续4 h监测AUGNRs与10 mmol/L的GSH溶液混合后的荧光强度。荧光强度在加入GSH后5 min内快速升高至最大值，随后降低一定强度后达到相对稳定状态，且在4 h内无明显降低，这表明AUGNRs产生的荧光信号可在较长时间内保持在一个相对稳定的强度区间内。

2.3 AUGNRs的光热性质

图3A所示为不同质量浓度（12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml）的AUGNRs的光热效果。在波长为808 nm的激发光以1.5 W/cm2的功率照射下，AUGNRs的温度在5 min内明显上升，且25 μg/ml AUGNRs的温度可达45℃，达到对肿瘤细胞的杀伤效果，且光热效果随AUGNRs质量浓度的增高而升高；而作为对照组的水在5 min内仅增加了1.7℃，表明NIR对水的加热效果很小。图3B为照射前后AUGNRs的紫外-可见-近红外吸收光谱，照射后AUGNRs的LSPR仅有10 nm左右的红移，表明NIR的照射对AUGNRs的结构和性能无显著影响。2.4AUGNRs的细胞摄取

为将AUGNRs用于细胞实验进行效果评估，首先需证明其可有效地被肿瘤细胞所摄取。文献报道，乳腺癌4T1细胞内高表达GSH，而GSH可介导AUGNRs的荧光恢复。图4所示为荧光显微镜下4T1细胞分别与AUGNRs、UGNRs、PBS共培养2 h后的图像，其中蓝色为DAPI，表示细胞核，红色为Cy5。由图4可知，UGNRs和PBS组中均无红色荧光出现；而AUGNRs组中红色荧光大量出现于细胞核周围，表明AUGNRs可高效地被肿瘤细胞摄取，并可被肿瘤细胞内高表达的GSH介导实现Cy5的荧光恢复。

2.5 AUGNRs的生物相容性和光热治疗效果评价

4T1细胞与AUGNRs共培养24 h后的细胞存活率、4T1细胞与AUGNRs共培养24 h后再使用808 nm的NIR以1.5 W/cm2的功率照射5 min后的细胞存活率如图5A所示。当未给予NIR照射时，即使AUGNRs的质量浓度高达400 μg/ml，细胞存活率仍有93%左右；在给予808 nm的NIR照射后，细胞存活率明显降低，且AUGNRs的质量浓度越高，细胞存活率越低，当AUGNRs的质量浓度为400μg/ml时，细胞存活率仅为17.6%，与未给予NIR照射时相同质量浓度AUGNRs下的细胞存活率相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。图5B、5C为使用Calcein-AM与PI分别对与质量浓度为400 μg/ml的AUGNRs共培养24 h后给予NIR与未给予NIR处理的4T1细胞进行染色后所得的荧光显微图，其中由PI染色的死细胞为红色，由Calcein-AM染色的活细胞为绿色。所得结果与MTT比色法测得结果相一致，给予NIR照射后，4T1细胞大量死亡，而未给予NIR照射时，细胞几乎不受影响。以上结果表明，AUGNRs对4T1细胞所造成的毒性小，具有良好的生物相容性；同时，在给予NIR照射后，其可产生明显的光热效果，有效杀死4T1肿瘤细胞。

3 结论

本研究成功制备了荧光信号可激活的诊疗一体化多功能分子探针——AUGNRs，并对其粒径、形态、Zeta电位及紫外-可见-近红外吸收光谱进行了表征。光热特性研究结果表明，AUGNRs可有效地将NIR转化为热能，并在短时间内快速升温；而荧光释放实验结果证明，AUGNRs在GSH存在的情况下可实现荧光信号由“关闭”状态向“激活”状态的转变；细胞摄取实验结果显示，AUGNRs可被乳腺癌4T1细胞高效、快速地摄取，并可检测到Cy5的荧光信号；探针生物相容性实验和4T1肿瘤细胞光热治疗实验结果表明，AUGNRs在无NIR照射下，对细胞生长无明显影响，而在给予NIR照射后，则可有效杀伤肿瘤细胞。本研究为GNRs在临床肿瘤特异性诊断与光热治疗中的应用提供了新思路。

利益冲突无

（图2、3、5见插页6-9，图4见插页6-10）

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ObjectiveTo develop a fluorescence signal activatable multifunctional molecular probe with theranostics function through combining ultrasmall gold nanorods(UGNRs)with fluorescein,and to evaluate its therapeutic effect on photothermal therapy(PTT)in breast cancer cells.MethodsThe UGNRs were synthesized by the one-pot seedless method,then the functionalized modification of UGNRs were conducted using cysteamine. Finally,the activatable ultrasmall gold nanorods(AUGNRs)were synthesized by amide condensation of—NH2of cysteamine and—COOH of carboxylated fluorescein Cy5.The cell uptake ability and GSH-mediated imaging ability of AUGNRs were studied using breast cancer 4T1 cells.4T1 cells co-cultured with AUGNRs were irradiated with 808 nm excitation light,and the PTT effects were assessed by MTT colorimetric staining and calcein-AM/PI staining. ResultsThe AUGNRs were synthesized successfully,which could be uptaken by 4T1 cells quickly and efficiently, and could achieve intracellular glutathione(GSH)triggered fluorescence recovery.No obvious cytotoxicity of AUGNRs to 4T1 cells was observed in the co-cultivation.Moreover,obvious PTT effects could be induced by 808 nm laser,which could effectively kill 4T1 cancer cells.ConclusionThe fluorescence signals of AUGNRs can be induced by intracellular GSH,and tumor cell destruction can be achieved by 808 laser-excitated PTT effects.

Ultrasmall gold nanorods;Photothermal therapy;Fluorescence;Glutathione

Zhang Xuening,Email:luckyxn_tianjin@163.com

天津市自然科学基金（13JCYBJC23800）；天津市卫生局科技基金（2014KZ108）

2016-08-20）

张雪宁，Email:luckyxn_tianjin@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.06.003

Activatable ultrasmall gold nanorods for theranostics in breast cancer cellsZhao Feixiang,Li Jiang,Wang Lingwei,Wu Minghao,Zhang Xuening

Department of Radiology,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China