PEG对肝素化PCL/PEG人工血管膜材料中肝素释放的影响

毛迎李超婧王富军丁雯米杏妍王璐

201620上海，东华大学纺织学院，纺织面料技术教育部重点实验室

PEG对肝素化PCL/PEG人工血管膜材料中肝素释放的影响

毛迎李超婧王富军丁雯米杏妍王璐

201620上海，东华大学纺织学院，纺织面料技术教育部重点实验室

目的研究聚乙二醇（PEG）的加入对肝素化聚己内酯/聚乙二醇（PCL/PEG）人工血管膜材料中肝素体外释放的影响。方法通过共混法和冷冻干燥技术制备不同PEG质量分数（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜材料，并通过体外释放实验考察PEG的加入对肝素释放性能的影响。同时，通过X射线衍射、傅里叶红外光谱和差示扫描热分析仪探究PEG的加入对基体结构性能的影响。结果PEG的加入降低了肝素从基体释放的难度，提高了肝素第1天的平均释放速率和34 d内的累积释放率，且两者在一定程度上随着PEG质量分数的增加而增大。X射线衍射、傅里叶红外光谱和差示扫描热分析结果均表明，肝素的加入会使PCL膜的结晶度在一定程度上有所增大，但整体影响并不显著，且肝素的加入会促进PEG晶粒的生长，肝素和PEG在基体中呈现共域化分布。结论利用共混法和冷冻干燥技术制备了肝素化PCL/PEG膜材料，并可通过调控PEG的质量分数在一定程度上实现对肝素释放行为的控制，进而预测试样在一定程度上具有抗凝作用，该材料有望用作小口径人工血管膜材料。

肝素化；共混；药物缓释；血管膜材料

Fund program:Natural Science Foundation of China(81371648);Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(2016);Project 111(B07024);National Postdoctoral Foundation(2016M590299);Science and Technology Support Program of Shanghai(16441903803)

0 引言

20世纪60年代起,研究者开始利用肝素化来提高材料的抗凝血性[1]，目前肝素化研究仍是一个很热门的方向。肝素化的定义可概括为肝素或其衍生物在材料上的固定化[2]，它是提高材料血液相容性的重要方式。临床上通常采用肝素注射的方法来提高抗凝血性，但注射肝素会引起各种并发症，从而限制了一些临床上高难度手术的进行。然而，肝素化的推广在一定程度上解决了以上问题。目前，许多学者已成功实现了肝素分子在生物材料表面上的固定化，从而大大提高了血液接触材料的抗凝血性能[3-6]。肝素化的方法有很多，按其固定化力的性质，可分为物理吸附[7]和化学结合两大类,而化学结合又可进一步分为离子键合法和共价键合法[8]。虽然肝素以共价键和离子键的形式结合到血管移植物的管腔内表面，一定程度上阻止了血栓的形成，但仍存在一些问题。共价键的结合方式可牢固地将肝素固定在材料表面，但会破坏肝素的功能构象，导致抗凝功能发挥不充分；而离子键的结合方式虽保证了肝素功能的发挥，但其结合能力较弱，难以实现长期抗凝的功能。相对来说，共混法是实现材料肝素化的最简单方法，且该法既不会破坏肝素的共价键，也不易导致肝素失效；但会导致大多数肝素或其衍生物被包埋在材料内部而不能发挥作用[9]，故如何解决肝素的释放成为了研究的关键。本研究利用共混法和冷冻干燥技术制备了肝素化聚己内酯/聚乙二醇（ploy（ε-caprolactone）/polyethylene glycol,PCL/PEG）膜材料，探究了不同PEG质量分数的肝素化PCL/PEG膜材料的药物释放性能，并采用多种表征手段对其结构性能进行了一系列的表征，进一步分析PEG的加入对肝素化PCL/PEG膜材料中肝素释放的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

肝素（效价≥170 U/mg）、PEG（相对分子质量为4 000 u）、乙酸（分析纯）、甲苯胺蓝（相对分子质量为305.8）（国药集团化学试剂有限公司），PCL（相对分子质量为80 000 u）（深圳市光华伟业实业有限公司）。

X85-2S恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司），FD-1A-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司），TS-100C恒温摇床（上海柏欣仪器设备厂），TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），D/max-2550PC X射线多晶衍射仪（日本Rigaku公司），Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），DSC4000差示扫描热分析仪（美国PerkinElmer公司）。

1.2 方法

1.2.1 肝素化PCL/PEG膜的制备

将总质量为2.2 g的PCL和PEG按一定质量比溶于22 ml乙酸中，磁力搅拌，完全溶解后向其中加入2.2 ml质量分数为1%的肝素水溶液，混匀并将其倒入干净的玻璃皿中，冷冻干燥后得不同PEG质量分数（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜。

1.2.2 体外缓释

准确称取0.5 g肝素化PCL/PEG膜，将其放入含150 ml磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）的白口瓶中；将白口瓶放入恒温摇床中，摇床温度设为37℃，转速设为120 r/min；分别于1、4、8、24 h（1 d）、96 h（4 d）、192 h（8 d）、312 h（13 d）、456 h（19 d）、624 h（26 d）和816 h（34 d）时从白口瓶中抽取2．5 ml浸提液，按对应的编号做好标记，再补充2.5mlPBS至白口瓶中；根据甲苯胺蓝分光光度法[10]，分别向浸提液中加入2.5 ml甲苯胺蓝溶液后置于恒温摇床中，37℃反应0.5 h，使肝素钠与甲苯胺蓝反应形成配合物；再加入2 ml正己烷，充分振荡1 min，将配合物萃取至有机层，未络合的甲苯胺蓝则仍留在水相中；取下层水相，使用分光光度计测其在631 nm处的吸光度值，进一步分析获得不同时间点对应的浸提液中肝素钠的含量。

1.2.3 测试与表征

（一）X射线衍射分析

使用X射线多晶衍射仪分别测定PCL/PEG膜、肝素和肝素化PCL/PEG膜的结晶结构。衍射源为Cu/K-α1，电压为40 kV，电流为200 mA，扫描速度为3°/min，扫描范围为5°～60°。

（二）傅里叶变换红外光谱分析

使用傅里叶变换红外光谱仪分别对肝素、PCL膜、PCL/PEG膜和肝素化PCL/PEG膜的化学结构进行比较和表征，波数扫描范围为500～4 000 cm-1。

（三）差示扫描热分析

采用差示扫描热分析仪对不同PEG质量分数的试样进行测试。单次测试样品质量为5 mg，气氛为氮气，升/降温速率为10℃/min，温度扫描范围为-30～80℃。

图2 不同聚乙二醇质量分数的肝素化聚己内酯/聚乙二醇膜的肝素释放特征图

1.3 统计学方法

采用SPSS Statistics 23.0统计学软件处理数据，数据均以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体外释放

不同PEG质量分数（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜的肝素释放曲线和特征图分别如图1和2所示。由图1、2可看出，不添加PEG时，肝素被包裹在PCL基体内难以释放出来；4 d内肝素的累积释放率基本不发生变化，后期随着PCL基体的溶胀，肝素渐渐释放出来，但34 d内肝素的累积释放率＜15%。当加入PEG之后，第1天的肝素平均释放速率和34 d内的肝素累积释放率均大幅提高（均P＜0.001）；在一定范围内，随着PEG质量分数的增加，肝素第1天的平均释放速率和34 d内的累积释放率均逐渐增加。此外，由于PCL膜材料疏水且降解较慢，在释放第1天，被包裹在膜内的肝素随着PEG的溶出而产生突释；在第2～8天，加入PEG的共混膜中几乎无肝素释放出来，推测PEG在第1天即已从共混膜中完全溶出，且8 d内PCL膜在中性环境中可能还未发生降解；后来随着浸提液侵入PCL基体内部，材料发生溶胀，肝素才渐渐释放出来，预计随着材料的降解肝素能在后期被缓慢释放出来。

2.2 X射线衍射分析

图3为肝素化PCL/PEG膜材料的X射线衍射图。由图3可知，低相对分子质量的肝素为完全非结晶的物质；在19°附近是PEG的特征衍射峰[11]，峰值较小但峰形尖锐，21°附近是PCL的特征衍射峰[12]，峰值高而峰形尖锐，24°附近是PEG和PCL特征衍射峰的叠加。此外，PCL/PEG膜的结晶度为73.57%，而肝素化的PCL/PEG膜的结晶度为79.65%，可推断肝素的加入对试样结晶度的提升并不显著。但是，从19°附近PEG的特征衍射峰可看出，加入肝素后，试样的峰值变强，这说明肝素的加入能促进PEG晶体的生长；从侧面也反映出肝素和PEG在PCL基体中呈现共域化分布的趋势[13]，而这种分布有利于肝素从基体中被释放出来。

2.3 傅里叶红外光谱分析

图4和图5分别为肝素化PCL膜和PCL/PEG膜材料的傅里叶红外光谱图。研究结果显示，肝素在3 450 cm-1和1 620 cm-1附近具有明显的特征峰，其中3 450 cm-1附近的特征峰分布较宽；PCL膜在3 000 cm-1和1750 cm-1附近具有明显的特征峰，其中1750cm-1附近的特征峰非常尖锐；在PCL膜中加入肝素后，试样的特征峰在3 450 cm-1和1 620 cm-1附近略有变化，其他特征峰位置基本无变化，但试样的峰强度有所增强；而在PCL膜中加入PEG则使试样的峰强度变大，但变化不太明显；当在PCL膜中同时加入PEG和肝素时，试样的峰强度明显增大，结合X射线衍射的分析结果可推断肝素对PEG的结晶具有一定的促进作用。

2.4 差示扫描热分析

不同PEG质量分数的肝素化PCL/PEG膜的差示扫描热分析结果如图6所示。PCL膜的熔融温度在60℃左右；当PCL膜中加入PEG后，熔融峰值向高温偏移，能稍微提高PCL膜的熔融温度，但熔融峰面积明显减小，说明PEG的加入在一定程度上可使PCL膜的结晶度降低；当PCL膜中混入肝素时，PCL膜的熔融峰变得很宽，几乎出现了双峰值，且熔融温度降低；当肝素化PCL/PEG膜中PEG的质量分数增至15%时，熔融性能又恢复。这说明肝素的加入对基体的结晶性能具有一定的影响，而PEG的加入可在一定程度上降低肝素对PCL膜结晶性能的改变。总之，PEG的加入在一定程度上降低了肝素从试样中的释放难度。

3 讨论与结论

肝素是一类重要的抗凝血药物，应用于临床已有80多年[14-15]。肝素主要由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成，其分子中含有两类活性基团,分别是—SO3-及—COO-等负离子和—OH及—NH—等官能团[9,16]。其中，负离子上的抗衡离子可进行离子交换；而—OH及—NH—上的氢能发生一系列的功能性反应。因此，利用离子交换反应及活泼氢原子的反应可将肝素分别以离子键和共价键固定在高分子的主链或侧链上，实现本体材料的肝素化，但这或多或少会破坏肝素的活性。将肝素或其衍生物直接混入高分子材料中是实现材料肝素化的最简单方法，且不会破坏肝素的活性，但该法会导致大多数肝素或其衍生物被包埋在材料内部而不能发挥其作用[9]，故如何解决肝素的释放成了研究的关键。

本研究通过简单的共混法和冷冻干燥技术将具有天然抗凝性的肝素钠引入PCL/PEG材料中，得到了一种肝素化PCL/PEG膜材料。研究结果显示，PEG的加入降低了肝素从基体释放的难度，提高了肝素第1天的平均释放速率和34 d内的累积释放率，且两者在一定程度上随着PEG质量分数的增加而增大。PEG具有良好的水溶性，当其与体液接触时易于从基体中溶出，从而为肝素的释放提供了通道；同时，肝素和PEG在基体中呈现一种共域化分布，这些对肝素从基体中的释放均是有利的。总之，本研究利用共混法和冷冻干燥技术制备了肝素化PCL/PEG膜材料，并可通过调控PEG的质量分数在一定程度上实现对肝素释放性能的控制，进而预测试样在一定程度上具有抗凝作用，该材料有望用作小口径人工血管膜材料。

利益冲突无

（图1、3～6见插页6-11）

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Influence of PEG on heparin release of heparin-loading PCL/PEG vascular prosthesis membranes

Mao Ying,Li Chaojing,Wang Fujun,Ding Wen,Mi Xingyan,Wang Lu
Textile College,Key Laboratory of Textile Technology,Ministry of Education of China,Donghua University,Shanghai 201620,China

ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofpolyethyleneglycol(PEG)onheparinreleaseofheparinloaded polycaprolactone/polyethylene glycol(PCL/PEG)membranes used in artificial vascular peosthesis.Methods Heparin-loaded PCL/PEG membrane samples with different PEG mass contents of 0,0.5%,10%and 15%were prepared by blending method and freeze-drying technology.The influence of PEG on heparin release was experimental studied in vitro.The influence of PEG on the structural characteristics of the samples were investigated by X-ray diffraction,Fourier transform infrared spectrum and differential scanning calorimeter.ResultsThe addition of PEG reduced the heparin release resistance.The results showed that the average release rate of heparin in the first day and the release amount for 34 d were improved.Both these parameters increased with the increase of PEG mass content.The X-ray diffraction,Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed that the crystallinity of PCL membrane was slightly enhanced by the addition of heparin,but the overall effect was not significant.In addition,the addition of heparin could promote the crystalline grain growth of PEG,and a common distribution of heparin and PEG in the matrix was observed.ConclusionsThe heparin release control can be achieved by adjusting the PEG mass content in heparin-loading PCL/PEG membranes prepared by blending method and freeze-drying technology.The proposed samples may have anticoagulant effect,which can be expected to be used as small-diameter artificial vascular prosthesis material.

Heparinization;Blending;Sustained release;Vascular membrane material

s:Wang Fujun,Email:wfj@dhu.edu.cn;Wang Lu,Email:wanglu@dhu.edu.cn

国家自然科学基金（81371648）；中央高校基本科研业务费基地项目（2016）；“111计划”（B07024）；中国博士后科学基金（2016M590299）；上海市科技支撑项目（16441903803）

2016-07-11）

王富军，Email:wfj＠dhu．edu．cn；王璐，Email:wanglu＠dhu．edu．cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．007