胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶及用于兔骨髓间充质干细胞的三维培养

张洋王静洁任颖刘玲蓉

300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室

·论著·

胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶及用于兔骨髓间充质干细胞的三维培养

张洋王静洁任颖刘玲蓉

300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室

目的构建一种模拟细胞外基质的胶原模拟多肽-聚乙二醇（PEG）杂化水凝胶并应用于兔骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的三维（3D）培养。方法利用胶原模拟多肽末端的半胱氨酸与马来酰亚胺修饰的多臂PEG偶联形成杂化水凝胶，圆二色谱表征胶原模拟多肽的三螺旋结构及其热稳定性，流变学检测和扫描电镜观察研究杂化水凝胶的成胶过程、机械强度及水凝胶内部结构。将rBMSCs包埋于杂化水凝胶中进行3D培养，检测水凝胶的细胞相容性及其对rBMSCs分化的影响。结果胶原模拟多肽能自发形成天然胶原的三螺旋结构，其热变性温度为49.4℃。胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶成胶迅速，内部呈现多孔的网络状纤维结构；杂化水凝胶3D培养rBMSCs 24 h后，绝大部分细胞保持存活状态，基因表达分析结果显示该水凝胶体系构建的3D培养环境能影响rBMSCs的分化。结论胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶制备条件温和，具有良好的机械强度和细胞相容性，有利于rBMSCs的软骨分化。

胶原模拟多肽；水凝胶；兔骨髓间充质干细胞

Fund program:National Natural Science Foundation of China(31170917)

0 引言

细胞外基质对组织细胞起支持、保护和营养作用，对细胞的增殖、分化等生命活动具有重要影响[1]。水凝胶能模拟天然细胞外基质的结构和理化特性，允许细胞生存的营养物质和代谢产物的渗透和扩散，为细胞提供类似软组织的三维（three-dimension，3D）微环境，因而成为研究和应用广泛的生物医用材料[2]。合成的水凝胶——聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）及其衍生物水凝胶，具有良好的生物相容性、结构和性能可控等特点，但存在生物活性差的缺点，故需要通过生物活性分子修饰以改善其降解性能、促细胞生长和分化的生物活性[3]。

胶原是细胞外基质的主要成分，其参与细胞的极化、分化、形态发生等行为和创伤愈合、血栓形成、免疫系统调节等过程，且可生物降解，是一种应用广泛的生物材料[4]。随着多肽固相合成技术的发展和应用，研究者根据胶原的结构特点设计了胶原模拟多肽（collagen mimetic peptides），这些短肽通常由单纯Gly-Xaa-Yaa重复序列或Gly-Xaa-Yaa重复序列整合某些生物活性序列组成，可以形成胶原典型的三螺旋构象[5]。近年来，基于胶原模拟多肽水凝胶体系的研究越来越多，Lee等[6]为了提高PEG光敏水凝胶的生物活性，通过接枝胶原模拟多肽促进其3D培养的软骨细胞分泌细胞外基质、抑制软骨细胞的脱分化。Kumar等[7]利用赖氨酸、天冬氨酸之间的盐桥作用使含有黏性末端的胶原模拟多肽发生横向、纵向交联作用而形成多肽水凝胶，该水凝胶可激活血小板，加速止血而不引起强烈的炎症反应。

本研究设计合成了包含Gly-Xaa-Yaa重复序列和细胞黏附序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）的胶原模拟多肽，通过胶原模拟多肽与多臂PEG偶联构建了一种新型胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶，同时具备胶原模拟多肽良好的生物活性和PEG的机械加工性能，从而为细胞生长提供有利的微环境，将该水凝胶体系用于兔骨髓间充质干细胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, rBMSCs）的3D培养并评价其细胞相容性及对细胞分化的影响，为发展新型生物活性水凝胶体系提供现论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

胶原模拟多肽（GPO）8-CG-RGDS（序列为GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOCGRGDS，纯度＞90%）（吉尔生化（上海）有限公司，相对分子质量为40ku的马来酰亚胺修饰的4臂PEG（4臂PEG-MAL-40k）（北京键凯科技有限公司），日本大耳白兔骨髓间充质干细胞（笔者通过全骨髓贴壁法分离制得），DMEM高糖培养基（美国HyClone公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（北京索莱宝科技有限公司），胎牛血清、LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒（美国Invitrogen公司），24孔板用Millicell细胞培养小室（1μm耐高温聚酯薄膜）（美国Millipore公司），E.Z.N.A.®HP总RNA提取试剂盒（美国Omega公司），GoScriptTM反转录试剂盒、GoTaq qPCR Master Mix（美国Promega公司）。

J-815圆二色谱仪（日本Jasco公司），MCR302高级旋转流变仪（奥地利Anton Paar公司），SUPRA 55VP扫描电子显微镜（德国Carl Zeiss公司），DMIL倒置荧光显微镜（德国Leica公司），7500实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 胶原模拟多肽的圆二色谱

用纯水配制质量浓度为0.3 mg/ml的胶原模拟多肽溶液，并于4℃平衡12 h以上，用圆二色谱仪测定胶原模拟多肽的圆二色谱，再将圆二色谱测试结果用如下公式换算为氨基酸残基平均摩尔椭圆率（mean residual ellipticity,MRE）[θ]

式中：θ为样品的椭圆率值（mdeg），m为样品的摩尔质量（g/mol），c为样品的质量浓度（mg/ml），l为石英比色皿的光程（cm），nr为样品的氨基酸个数。

常温圆二色谱：扫描范围为190～260 nm，扫描速度100 nm/min，带宽1 nm，每隔0.1 nm取1个点，椭圆率取3次扫描的平均值，并自动去基线；先将纯水注入石英比色杯，测基线；然后将胶原模拟多肽溶液注入石英比色杯，润洗1次后，检测样品。变温圆二色谱：检测波长为225 nm，带宽1 nm，起始温度20℃，终止温度80℃，升温速率0.1℃/min，等待时间4 s，每隔0.2℃取1个点；将纯水注入石英比色杯，测基线；将胶原模拟多肽溶液注入石英比色杯，检测样品。热变性曲线用Adjacent-averaging法平滑后求一阶导数，一阶导数拐点对应的温度为热变性温度Tm。

1.2.2 胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的流变学特征

用PBS分别配制质量浓度为24 mg/ml的胶原模拟多肽溶液和96 mg/ml的4臂PEG-MAL-40k溶液，将两者等体积混合，得6%胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶。在高级旋转流变仪的样品台上原位制备胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶，并使用25 mm、2°锥角的椎板测量夹具依次进行时间扫描（time sweep）、频率扫描（frequency sweep）和振幅扫描（amplitude sweep）。

时间扫描：设置温度为25℃，扫描频率1 Hz，扫描振幅0.1%应变，取等体积的胶原模拟多肽溶液和PEG溶液于样品台混合后，迅速降下椎板，观察样品储能模量（G'）、损耗模量（G''）随时间的变化。频率扫描：时间扫描完成后，设置扫描频率100～0.1 rad/s，扫描振幅0.1%应变，观察样品G'、G''随频率的变化。振幅扫描：设置温度为25℃，扫描频率10 rad/s，扫描振幅0.01～100%应变，观察样品G'、G''随振幅的变化。

1.2.3 胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的扫描电子显微镜观察

用PBS分别配制质量浓度为24 mg/ml的胶原模拟多肽溶液和96 mg/ml的4臂PEG-MAL-40k溶液，等体积混合形成水凝胶后，冷冻干燥，然后撕下一小块贴在导电胶上，喷金后用扫描电子显微镜进行观察。

1.2.4 rBMSCs的3D培养

rBMSCs长满后用胰酶消化并离心，加入1 ml培养基重悬调细胞浓度约为4.3×106/ml；向放有多肽的1.5 ml离心管中加入适量细胞悬液，配制成质量浓度为24 mg/ml的胶原模拟多肽溶液，记为A；向存有PEG-MAL-40k的1.5 ml离心管中加入适量PBS，配制成质量浓度为96 mg/ml的4臂PEGMAL-40k溶液，记为B；各取90 μl A、B于Millicell细胞培养小室内混合，静置10～15 s等待水凝胶形成；将细胞培养小室转移至24孔板，外侧加800 μl培养基，设3个平行样，另做3孔平板培养作为对照；最后将细胞置于37℃的CO2恒温培养箱中培养。实验重复3次。

1.2.5 胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶中的细胞活力分析和基因表达检测

从-20℃冰箱取出LIVE/DEAD®细胞活力/毒性试剂盒，恢复至室温；取5 ml PBS加入10 μl溴乙啡锭二聚体，混匀后得A；向A中加入2.5 μl钙黄绿素-AM，混匀得LIVE/DEAD染色液（2 μmol/L钙黄绿素-AM、4 μmol/L溴乙啡锭二聚体）；取3D培养1 d的rBMSCs，用PBS洗涤Millicell细胞培养小室外侧3次，将细胞培养小室转移至干净的培养孔，外侧加800 μl染色液，将24孔板置于37℃的CO2恒温培养箱孵育40 min后，用倒置荧光显微镜观察，实验操作应尽可能避光。

rBMSCs在杂化水凝胶中包载2 d后，用PBS重悬胶，收集细胞并提取RNA，逆转录合成cDNA后，用实时荧光定量PCR仪分析检测软骨分化标志基因COL2A1、ACAN、SOX9和肥大分化标志基因COL1A2、COL10A1、MMP13的表达变化。（表1）

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件学处理数据，数据以均值±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用独立样本的t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 胶原模拟多肽的三螺旋结构及其热稳定性

本研究设计合成的胶原模拟多肽包含胶原三螺旋重复序列（Gly-Xaa-Yaa）n和促细胞黏附序列RGD，同时多肽末端加入半胱氨酸。利用圆二色谱表征了设计合成的胶原模拟多肽的三螺旋结构及其热稳定性，天然胶原由3条呈聚L-脯氨酸Ⅱ型左手螺旋构象的α链缠绕形成右手超螺旋，在圆二色谱上表现为196.5 nm的负峰和220 nm处的正峰[8]。图1A为胶原模拟多肽的常温圆二色谱，其最大负吸收峰位于198.1 nm，最大正吸收峰位于225.5 nm，色谱峰呈倒“S”形，说明胶原模拟多肽在溶液中能形成类似于天然胶原的三螺旋构象。

表1 相关基因引物序列

天然胶原的三螺旋结构在高温条件下会发生解螺旋，即热变性反应。胶原的热稳定性可用变性温度Tm表示，当温度高于Tm时，胶原的三螺旋构象去折叠，解旋为α单链。胶原模拟多肽和天然胶原有类似的热变性反应，其热稳定性常用圆二色谱225 nm处椭圆率随温度的变化来评价。胶原模拟多肽的热变性曲线中（图1B），椭圆率在20～35℃变化不大，35～65℃急剧下降，65～80℃又趋于平稳，三螺旋结构的解旋主要发生在35～65℃。对热变性曲线平滑后求导（图1C），MRE一阶导数的拐点位于49.4℃附近，即胶原模拟多肽的Tm为49.4℃。本研究室曾测定了天然胶原在体积分数为0.3%的丙二酸溶液中的热变性曲线，当升温速率为0.5℃/min时，胶原的Tm为43℃。另外，天然胶原的热变性是不可逆的，而胶原模拟多肽的热变性是可逆的，可通过低温退火重新组装为三螺旋结构[9]。

2.2 胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的流变学和结构特征

本研究制备的胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶是利用胶原模拟多肽末端的半胱氨酸与4臂PEGMAL每个高分子臂末端的马来酰亚胺官能团发生偶联反应，进而通过胶原模拟多肽的三螺旋结构自组装形成物理交联的水凝胶网络，制备条件温和，适合应用于细胞培养。水凝胶的力学性质对包载细胞的表型、细胞吸附和基因表达有重要影响，是评价水凝胶是否适合特定生物应用的重要指标[10]。

流变学检测是研究水凝胶物理性质的基本方法。流变学用G'和G''来描述材料的黏弹性，当G'＜G''时，材料更多地表现为流体特性，可视为流体；G'＞G''时，材料更多地表现为固体特性，可视为水凝胶[11]。采用时间扫描、频率扫描和振幅扫描检测研究了胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的流变学特性。时间扫描用于研究水凝胶的形成过程，结果如图2A所示，开始阶段G'＜G''，表现为流体；在成胶过程中，G'不断增大，直到G'＞G''，表现为固体（凝胶），G'继续增大至平台期，凝胶化过程完成，胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶形成过程约需要30 min。频率扫描用于评价材料在高剪切力和低剪切力条件下材料的机械特性（图2B）。振幅扫描可以确定测试样品的线性黏弹区间，由图2C可知，胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的线性黏弹区在0.01%～10%附近。

图1 胶原模拟多肽的圆二色谱图

图3 胶原模拟多肽-聚乙二醇杂化水凝胶的扫描电镜图

图5 胶原模拟多肽-聚乙二醇杂化水凝胶培养48 h对免骨髓间充质干细胞分化的影响

为了解胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的形貌结构，将水凝胶冻干后喷金进行了扫描电镜观察，如图3所示，水凝胶呈现多孔的网络状纤维结构。2.3胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶中的细胞活力分析

胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的细胞相容性用LIVE/DEAD®活力/细胞毒性试剂盒检测。死细胞在绿色激发光下表现为红色荧光，活细胞在蓝色激发光下表现为绿色荧光。rBMSCs在水凝胶中培养24 h后用试剂盒染色，由图4可看出，蓝光激发下，呈现大量绿色荧光；绿光激发下，存在少量红色荧光，说明rBMSCs绝大部分保持存活状态，胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶具有良好的细胞相容性。2.4胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶中3D培养对rBMSCs基因表达的影响

与传统的二维（two-dimension，2D）培养相比，3D培养能更好地模拟细胞在体内的状态，促进细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用，影响细胞的信号转导，进而影响细胞的形态功能[12-13]。胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶包埋rBMSCs培养48 h后，考察了水凝胶体系构建的3D培养环境对rBMSCs COL2A1、ACAN、SOX9、COL1A2、COL10A1和MMP13 6种基因表达的影响，相对于2D培养，3D培养的rBMSCs的COL2A1、ACAN、COL10A1和MMP13表达增加，SOX9和COL1A2表达降低，但只有COL1A2表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。（图5）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可在体内或体外特定的诱导条件下分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞[14-15]，因其来源广泛、易于分离培养且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，被认为是用于病缺损组织再生修复治疗较理想的细胞来源。BMSCs诱导分化来源的软骨细胞存在去分化的肥大表型趋势，终末分化的软骨细胞也存在这种分化趋势[16]。COL2A1、ACAN和SOX9为软骨分化标志基因[17-18]，而COL1A2、COL10A1和MMP13[18-19]为肥大标志基因。研究结果显示，相对于2D培养，水凝胶体系构建的3D培养环境中rBMSCs的COL1A2表达显著降低，初步提示其对rBMSCs的分化有影响，更有利于软骨分化。然而，胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶的强度不足，在培养基中只能维持体系的完整性2～3 d，导致培养时间尚不足以维持rBMSCs的诱导分化，后续将考虑改善水凝胶体系构建的3D培养体系，尤其是水凝胶的强度。

3 结论

本研究利用胶原模拟多肽和多臂PEG构建了一种模拟天然细胞外基质的水凝胶体系，制备方法具有反应快速和条件温和的特点，制得的水凝胶具有良好的机械强度和多孔网络结构，适合应用于细胞的3D培养。胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶包埋rBMSCs 24 h后，细胞大部分保持存活状态，表明该水凝胶具有良好的细胞相容性；与2D培养相比，水凝胶体系构建的3D培养环境对rBMSCs的分化有影响，更有利于软骨分化。

利益冲突无

（图2、4见封三）

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Collagen mimetic peptide-PEG hybrid hydrogel for 3D culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Yang,Wang Jingjie,Ren Ying,Liu Lingrong
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China;Key Laboratory of Biomedical Materials of Tianjin,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo construct a extracellular matrix-like collagen mimetic peptide-PEG hybrid hydrogel and to study the usage of this hydrogel in 3D culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBMSCs).MethodsThe hybrid hydrogel was synthesised by conjugating the cysteine at the end of the collagen mimetic peptide with the maleimine-modified multi-arm PEG.The circular dichroism spectra were used to characterize the triple helix structure and thermal stability of the collagen mimetic peptides.The rheology test and scanning electron microscopy were used to study the gelation process,mechanical strength and internal structure of the hydrogel.The rBMSCs were embedded in the hybrid hydrogel for 3D culture.The cell compatibility of the hydrogel and its effect on differentiation of the cells was studied.ResultsCollagen mimetic peptides could promote spontaneous formation of triple helix structure in the natural collagen,and the thermal transition temperature was 49.4℃.The formation process of the collagen mimetic peptides-PEG hybrid hydrogel was rapid,in which the porous network-like fibrous structure was formed.After the encapsulation of rBMSCs within the hydrogel for 24 h,most of the cells remained viable.Gene expression analysis showed that the hybrid hydrogel could affect the differentiation of rBMSCs.ConclusionsThe collagen mimetic peptide-PEG hybrid hydrogel possesses the characteristics of mild preparation condition,good mechanical strength and good cell compatibility,and is favorable to chondrocyte differentiation of rBMSCs.

Collagen mimetic peptide;Hydrogel;Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Lingrong,Email:liu_lingrong@126.com

国家自然科学基金面上项目（31170917）

2016-10-12）

刘玲蓉，Email:liu_lingrong@126.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．001