高同型半胱氨酸血症对膜性肾病大鼠肾组织Nephrin WT1表达的影响

梁 静， 张 渊， 孟祥龙， 王 莉

(1.四川省医学科学院/四川省人民医院城东病区肾脏科， 四川 成都 610110 2.四川省医学科学院/四川省人民医院肾脏科， 四川 成都 610072)



高同型半胱氨酸血症对膜性肾病大鼠肾组织Nephrin WT1表达的影响

梁 静1， 张 渊2， 孟祥龙1， 王 莉2

(1.四川省医学科学院/四川省人民医院城东病区肾脏科， 四川 成都 610110 2.四川省医学科学院/四川省人民医院肾脏科， 四川 成都 610072)

【摘 要】目的:观察高同型半胱氨酸血症对膜性肾病(MN)大鼠肾组织Nephrin、WT1表达的影响，探讨MN足细胞损伤凋亡的可能发生机制。方法:将30只SD雄性大鼠随机分为正常组和模型组，正常组不给予任何处理，模型组尾静脉注射16mg/ kg阳离子化牛血清白蛋白(c-BSA)复制MN大鼠模型，于正式免疫第1，2，3，4周末检测24h尿蛋白(24h UTP)水平，并于第4周末检测大鼠血浆尿素(Ure)、血肌酐(Cre)及同型半胱氨酸(Hcy)水平。同时取材鉴定大鼠肾组织成模情况，免疫组化检测大鼠肾组织中Nephrin、WT1的表达，结果:模型组大鼠造模第4周成模稳定，病理表现典型。随造模时间延长，模型组24h UTP呈逐渐增加趋势，与前一周末比较差异均有统计学意义(P<0.01)，2、3、4周末24h UTP较正常组有明显增加(P<0.01)。Nephrin在模型组肾组织中表达较正常组显著减少(P<0. 01)，WT1的表达与正常组比较无显著差异。HCY与肾组织Nephrin的表达呈明显负相关，与第4周末24hUTP呈明显正相关，与血浆尿素、血肌酐、肾组织WT1无明显相关关系。结论:MN中高Hcy血症可能通过下调Nephrin的表达参与了足细胞的损伤凋亡过程，积极监测Hcy水平及控制高Hcy血症有利于防止MN的进展。

【关键词】膜性肾病； 同型半胱氨酸； Nephrin； WT1； 阳离子化牛血清白蛋白

膜性肾病(Membranous nephropathy，MN)是成人肾病综合征的主要原因，严重地危害人类的健康，MN的发病机制复杂，目前认为足细胞的活化及损伤是膜性肾病发展的一个重要机制，当前研究主要针对足细胞病变所导致的肾小球滤过屏障的损伤[1]。Nephrin是近几年来发现的一种跨膜糖蛋白，它特异地表达在足细胞的裂孔膜上，对于维持正常的肾小球滤过功能具有重大意义[2]。WT1(Wilms.肿瘤抑制基因)是一种锌指样转录因子，定位于表达在足细胞核，是足细胞特异性标志之一，足细胞WTl蛋白表达的减少可作为足细胞凋亡的标志[3]。较多研究表明，肾病综合征患者Hcy水平较正常显著升高，其是否与MN肾组织Nephrin、WT1表达相关，尚未见报道。本研究通过监测MN肾组织中Nephrin、WT1的表达情况，并探讨其与Hcy水平的关系，为临床早期预测MN足细胞损伤提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料:天然牛血清白蛋白、无水乙二胺(EDA)、4M醋酸缓冲液(PH=4.75)(均购自国药集团化学试剂成都有限公司)，碳化二亚胺(EDC)、羊毛脂、液体石蜡(均购自厦门星隆达化学试剂公司)，PASM染色试剂盒及Masson染色试剂盒(购自福州迈新生物试剂有限公司)，兔抗大鼠IgG多克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记羊抗兔荧光抗体(武汉博士德生物公司)，兔抗鼠Nephrin抗体及WT1抗体(1:50，Santa Cruz公司，美国)。

1.2 模型制备与分组:成年健康雄性SD大鼠30只，适应性喂养7d，检测24h尿蛋白(24h UTP)，均小于5mg。大鼠随机分为两个组:正常组(10只)、模型组(20只)，参照改良Border方法[4]，将牛血清白蛋白经EDC处理后制成阳离子化牛血清白蛋白(c-BSA)，用c-BSA制作大鼠膜性肾病模型，模型组大鼠每只取CBSA 1mg溶解于0.5mL生理盐水中与等量不完全弗氏佐剂(自备)充分乳化，在大鼠颈背部皮下多点注射作预免疫。预免疫1周后正式免疫，每只造模大鼠隔日尾静脉注射C-BSA(16mg/ kg)[5]，连续4周，正常对照组大鼠隔日尾静脉注射等体积生理盐水，均连续4周。

1.3 模型鉴定:每组于正式免疫第1、2、3、4周末准确收集24h尿，定量检测尿蛋白浓度，计算24h UTP水平，于实验第4周末将大鼠处死取材，观察肾脏大小、颜色；取部分肾组织用4%中性甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋制成蜡块，切片，分别进行Masson、HE、PASM染色，光镜下观察肾组织病理改变情况；取部分肾组织石蜡包埋后切片，用抗体效价为1:40ul的异硫氰酸荧光素标记羊抗兔荧光抗体为二抗，兔抗大鼠IgG多克隆抗体为一抗，行间接荧光抗体染色法染色，荧光显微镜下行肾组织荧光定性观察，观察结果及判定用“+”表示:(+++ ~++++)荧光闪亮；(++)荧光明亮；(+)荧光较弱，但清楚可见；(±)极弱的可疑荧光；(-)无荧光。另取部分肾皮质分别用2.5%戊二酸、1%锇酸进行前固定和后固定，脱水、包埋、切片处理，1%醋酸铀染色，电镜观察肾组织病变情况。

1.4 血尿生化检测:于造模第1、2、3、4周末前1d使用代谢笼收集24h尿行尿蛋白定量检测，于造模第4周末右心室采血采用全自动生化分析仪检测血浆尿素(Ure)、血肌酐(Cre)及同型半胱氨酸(Hcy)浓度。

1.5 肾组织Nephrin、WT1的检测:均采用SP法，3um肾组织脱蜡至水，抗原热修复，3%的H2O2阻断清除内源性过氧化物酶；山羊血清封闭液30℃恒温封闭30min，分别用抗体效价为1∶50ul的兔抗大鼠Nephrin、WT1多克隆抗体4℃孵育过夜，滴加抗兔抗体(生物素标记)，室温孵育40min，滴加链霉亲和素(辣根过氧化物酶标记)，30℃孵育40min；最后加DAB显色，显微镜下控制显色反应，苏木素复染，中性树胶封片。肾实质细胞胞浆内棕褐色颗粒显示为阳性，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。Nephrin、WT1的免疫组化染色结果采用计算机医学病理图像处理系统进行分析。每例肾组织切片，在高倍视野下随机选取面积相似的10个肾小球，对选取的肾小球内Nephrin、WT1免疫组化阳性信号进行图像分析，计算阳性面积平均值，结果以阳性强度×阳性面积表示[6]。

1.6 统计学方法:全部数据采用SPSS17.0 for windows软件包统计分析，结果用均数±标准差表示，两组间样本均数比较采用t检验，组内各时间点比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析，P<0. 05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况观察:造模后模型组全部大鼠逐渐出现消瘦、懒动、纳差、精神不振，抓持反抗能力明显减弱，毛发欠光泽、脱落，部分大鼠出现腹水，阴囊水肿。肾组织较正常肾脏增大，包膜紧张，色稍白。

2.2 动物成模检测:模型组:光镜下可见肾小球肿大，球囊腔狭窄，肾小球毛细血管壁弥漫性增厚，部分GBM外侧可见“钉突”形成，上皮下大量颗粒状红染沉积物，肾小管上皮肿胀，管腔狭窄；电镜下可见GBM弥漫增厚，足突变平、融合或消失，上皮下可见分布不均的颗粒状电子致密沉积物。正常组无上述改变。(见图1)

2.3 临床血尿生化指标检测:组内比较:正常组各周末24hUTP无明显差异；模型组随造模时间延长，24hUTP逐渐增加，第2周末较第1周末增加显著，第3、4周末均较前1周末增加显著(P<0.01)。组间比较:模型组自第2周末起24hUTP均较正常组显著增加(P<0.01)。第4周末模型组Hcy水平较正常组显著升高(P<0.01)，而Ure、Cre较正常组无明显差异(P >0.05)。(见表1、表2)

表1 两组24h尿蛋白水平比较(±s，mg/ L)

表1 两组24h尿蛋白水平比较(±s，mg/ L)

注:与正常组比较，*P<0.01；同一组别，与第1周比较，▽P<0.01；与第2周比较，▼P<0.01；与第3周比较，◆P<0.01

组别　　例数　　第1周末　　第2周末　　第3周末　　第4周末正常组　10　5.57±0.45　6.27±0.40　5.66±0.34　7.87±1.07模型组　20　4.97±0.30　47.26±8.06*▽　77.13±10.26*▽▼120.52±15.49*▽▼◆

表2 两组血生化指标比较(±s)

表2 两组血生化指标比较(±s)

注:与正常组比较，*P<0.01

组别　　例数　Ure(mmoL/ L)Cre(umoL/ L)Hcy(umoL/ L)正常组　10　 6.59±2.43　 52.75±11.30　 6.65±1.23模型组　20　 7.15±2.15 60.24±13.6518.33±10.45*

2.4 肾组织Nephrin、WT1的表达情况:正常组肾组织切片中可见nephrin呈浅棕色染色沿肾小球毛细血管襻呈均匀、线状分布，肾小管有少量分布；模型组4周时Nephrin表达较正常组显著减少，表达不均，稀疏，部分区域表达消失，两组Nephrin表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。WT1于MN4周时在足细胞核的表达呈深棕色粗大颗粒，与正常组比较无显著性差异(P>0. 05)。(见表3、图2)

表3 4周末两组肾组织Nephrin、WT1的表达(±s)

表3 4周末两组肾组织Nephrin、WT1的表达(±s)

注:与正常组比较，*P<0.01

组别　　例数　Nephrin　WT1正常组　10　12.35±3.78　 25.45±11.37模型组　20　5.62±2.03*　 22.60±14.16

图1 两组大鼠第4周肾组织Masson、PASM染色、免疫荧光及电镜观察

图2 4周末两组肾组织Nep.7mm。82.7mm；S1；hrin、WT1的表达情况A为正常组；B为模型组

2.5 血Hcy与血浆Ure、Cre及肾组织Nephrin、WT1的相关性:经Pearson相关分析显示，模型组血浆Hcy与肾组织Nephrin的表达呈明显负相关(r=-0.364，P<0. 05)，与第4周末24hUTP呈明显正相关(r = 0.937，P< 0.05)，与血浆尿素、血肌酐、肾组织WT1无明显相关关系。

3 讨 论

膜性肾病(MN)近年来发病率逐年增长，目前认为MN发病中，足细胞的损伤凋亡有重要意义，足细胞的异常是导致蛋白尿的关键环节，当其出现损伤、凋亡，进而坏死、脱落，就会引起细胞数量减少和密度降低，尿蛋白漏出，导致肾小球进行性硬化及肾功能进展[7]。

Nephrin、WT1是近年来发现的足细胞相关蛋白，它们与足细胞及基底膜的结构和功能完整性滤过屏障的组成密切相关，因其特异地表达于足细胞，成为近年来研究足细胞疾病的热门之一，既往较多研究证实，在多种肾小球疾病中，晚期肾小球硬化均可见Nephrin mRNA和蛋白表达及分布的异常，以及肾小球WT1表达的减少[8]。本研究发现，模型组电镜下可见GBM弥漫增厚，足突变平、融合或消失，并可见上皮下电子致密物沉积。随造模时间延长，24hUTP逐渐增加，免疫组化发现模型组4周时Nephrin表达较正常组显著减少(P<0.01)，而WT1于MN4周时在足细胞核的表达与正常组无明显差异(P>0.05)，由此可见MN造模4周时足细胞裂孔膜即出现明显损伤，而此时足细胞细胞核无显著变化，细胞数量没有明显减少，足细胞凋亡尚未大规模启动，nephrin表达减少所表现的足细胞的损伤并没有引起足细胞从肾小球基底膜( GBM)上脱落。Nephrin是肾小球滤过屏障的关键，Taiji等[9]研究证实无论是否有足细胞的脱落，nephrin的异常都会导致蛋白尿。本实验也同样证实了这样的观点，虽然模型组nephrin表达减少，WT1没有明显变化，但此时蛋白尿已较正常组明显增加(P<0.05)，说明nephrin所反映的足细胞滤过屏障功能受损导致尿蛋白漏出。

足细胞的活化及损伤是MN发展的一个重要机制，电镜下MN早期即可见足突的广泛融合及消失。导致足细胞损伤的因素很多，包括:活性氧族(ROS)、高血压、高血糖、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、感染、毒物及药物等，从足细胞损伤到肾小球硬化是一个渐进性过程。有研究证实，其发展速度主要取决于足细胞损害及其损伤后数量减少的严重程度[10]。高同型半胱氨酸血症(HHcy)是动脉粥样硬化(AS)性心血管疾病的独立危险因素，其能否作为足细胞损伤肾小球硬化的又一因素，尚待研究。有研究表明，Hcy是一种含有硫基的血管损伤性氨基酸，参与血管病变的发生过程，其升高可直接造成血管内皮细胞损伤和血管功能异常。既往较多研究发现，肾病综合征患者普遍存在高Hcy血症。MN是肾病综合征的重要原因，也是典型的足细胞疾病，因此，在MN中，高Hcy血症是否与MN肾功能损害及足细胞病变有关，尚未见报道，本实验看到，模型组Hcy水平较正常组显著升高(P<0.01)，而Ure、Cre较正常组无明显差异，说明MN早期肾功能正常时，已经出现Hcy水平的异常，从相关分析看出:于造模第4周末Hcy水平与肾功能无明显关系，但随MN发展，高Hcy血症是否导致MN肾功能进一步受损，有待于后期实验进一步证实。

研究指出:Hcy导致血管病变的发生机制可能与Hcy刺激血管平滑肌细胞增殖、影响血管壁胶原合成与连接、促进脂质沉积以及通过氧化应激损伤血管内皮、抑制内皮细胞产生前列环素等有关，本研究显示，模型组血浆Hcy水平与肾组织Nephrin的表达呈明显负相关(r=-0.364，P<0.05)，与第4周末24hUTP呈明显正相关(r= 0.937，P<0.05)，与血浆尿素、血肌酐、肾组织WT1无明显相关关系，提示高Hcy可能是MN足细胞损伤的又一发病机制，从相关性分析推测，Hcy可能通过下调Nephrin的表达参与了足细胞的损伤凋亡过程，同时高Hcy血症加重尿蛋白的漏出，大量蛋白尿反过来加速了肾小球的硬化及足细胞的损伤，在足细胞损伤方面，与高Hcy导致血管病变的发生机制有所不同。

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The Effects of Hyperhomocysteinemia on the Expression of Nephrin and WT1 in Membranous Nephropathy Rats Renal Tissue

LIANG Jing， et al
(Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People's Hospital of east branch，Sichuan Chengdu 610110，China)

Abstract:Objective: To observe the effects of hyperhomocysteinemia (HHcy) on the expression of Nephrin and WT1 in renal tissues of MN rats，and to investigate the possible mechanism of MN podocytes apoptosis. Method: 30 SD male rats were randomly divided into normal group and model group，normal group without any treatment，Model group was duplicated by 16mg/ kg C-BSA tail vein injection on the basis of modified Border method. 24h urinary protein levels (24h UTP) were detected at the first，second，third and fourth weekend in formal immunity. Plasma urea (Ure)，serum creatinine (Cre) and homocysteine (Hcy) levels were detected at the fourth weekend. The expression of WT1 and Nephrin in rats renal tissues were detected by immunohistochemistry，and appraisal the MN model of rat kidney tissue. Result: The model is stable and the pathology is typical at the fourth weekend. 24h UTP gradually increased with the increase of the model time，and increased significantly compared to normal group at the third weekend (P<0.01). Nephrin expression in the model group was significantly decreased compared with the normal group (P<0.01)，the expression of WT1 was not significantly different from the normal group. The Hcy levels were significant negatively correlated with the nephrin expression，positively correlated with 24hUTP in fourth weeks，no significant correlation with Ure，Cre and expression of WT1. Conclusion: HHcy may down-regulate the expression of nephrin to participate in the apoptosis of the podocyte，actively monitor the levels of Hcy and control the HHcy to prevent the development of MN.

【Key words】Membranous nephropathy； Homocysteine； Nephrin； WT1； Cationic bovine serum albumin

【基金项目】四川省卫生厅科研课题，(编号:110238)通讯作者:王 莉，Email:scwangli62@ 163.com

【文章编号】1006-6233(2016)03-0470-05

【文献标识码】B 【doi】10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.03.042