SD大鼠骨髓间充质干细胞培养、纯化与鉴定

栾海燕，李广文，李　卉，王　军，辛　越，杨朝艳，田　青，何　伟，齐志远，曹思樟，吕波涛，裴永泉，梁　政，程硕



SD大鼠骨髓间充质干细胞培养、纯化与鉴定

栾海燕，李广文，李卉，王军，辛越，杨朝艳，田青，何伟，齐志远，曹思樟，吕波涛，裴永泉，梁政，程硕

[摘要]目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外培养、纯化及鉴定的方法。方法对1 w龄SD大鼠脱颈处死后，剥离大鼠两侧后肢股骨和胫骨提取BMSCs，采用全骨髓贴壁法分离、培养、纯化BMSCs，观察细胞形态变化，绘制生长曲线，并通过成骨、成脂诱导、克隆形成率等方法对其进行鉴定。结果应用全骨髓贴壁培养法体外分离、纯化、培养的SD大鼠BMSCs生长迅速、生长曲线较好，经过成骨、成脂、克隆形成率等方法鉴定证实其为SD大鼠BMSCs。结论全骨髓细胞贴壁培养法是分离、纯化与培养BMSCs的一种有效方法，能较快获得增殖能力较强的原代细胞用于实验研究。

[关键词]骨髓间充质干细胞；原代培养；纯化；大鼠

骨髓间充质干细胞（bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s，BMSCs）是骨髓内存在的一类非造血干细胞，也称骨髓基质干细胞（marrow stroma1 stem ce11s，MSCs）。其来源于中胚层间充质，在体内外具有支持和调控成骨的作用，并且在体内可分布于多种组织和器官，并具有多向分化潜能，能够向成骨系细胞、成纤维系细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化，因此也是多能或全能干细胞。在实验中获取符合要求的BMSCs就必须将其在体外进行分离、纯化、鉴定和增殖，以获取足量符合要求的BMSCs。本研究采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化、培养获取SD大鼠BMSCs，并对其进行多向分化和增殖潜能的鉴定，为相关实验研究提供依据。

1　材料与方法

1.1主要材料和设备1 w龄SD大鼠[第四军医大学实验动物中心SCXK（军）2013-009]，体重为50～80 g；酶标仪（BioTek，美国）；α-MEM培养基（Hyc1one，美国）；胎牛血清（SC浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，美国）；青霉素/链霉素（Sigma，美国）；L-谷氨酰胺；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、L-抗坏血酸（Vc）、地塞米松（Dex）、β-甘油磷酸钠（β-GP）、胰岛素、二甲基亚砜（DMSO）、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、油红O、CCK8试剂（Sigma，美国）；ALP染色试剂盒（碧云天，中国）；HERACELL细胞培养箱（Thermo，德国）；倒置相差显微镜及照相系统（CK40-F200，O1ymPas，日本）；体视显微镜（SZX-9，O1ymPas，日本）。

1.2方法

1.2.1细胞体外分离与培养将1 w龄健康SD大鼠脱颈处死后，75%酒精浸泡消毒3 min，在超净工作台无菌环境下使用原代器械盒冰上剥离出股骨和胫骨，放置于预冷的PBS溶液培养皿中，而后剪去股骨和胫骨两端，用1 m1注射器吸取10%胎牛血清的α-MEM培养液反复冲洗骨髓3次，至骨髓腔变白，收集所有冲洗培养液于10 m1离心管中。将收集好的离心管4℃1000 r/min离心5 min，去掉上清液，加入细胞培养液重悬细胞接种于75 cm2培养瓶中。放置在37℃5%CO2孵箱中培养，3 d后对培养瓶进行半换液，并在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况；5 d后全换培养液，培养7～10 d左右，细胞呈较为均匀的成纤维细胞样，紧贴培养瓶壁生长，长满90%左右，仅有部分杂细胞，可进行传代培养。

1.2.2细胞体外分离与培养当看到细胞呈较为均匀的成纤维细胞样，紧贴培养瓶壁生长，长满90%左右时方可以进行传代，一般按照1∶2或1∶3进行传代。具体方法是：倒掉废液，用5～10 m1 PBS液漂洗1～3次，倒置显微镜下观察死细胞或衰老细胞是否洗净；而后加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶2～3 m1，置37℃、5%CO2孵箱中进行消化；倒置显微镜下观察细胞消化状态，细胞凸起缩为圆形时，加入等量的10%胎牛血清的α-MEM培养液终止消化，并使用滴管反复吹打培养瓶底壁细胞，注思不要产生气泡影响细胞活性。收集培养液于10 m1离心管中，4℃1000 r/min离心5 min，去掉上清液，加入细胞培养液重悬细胞，等量接种于2～3个75 cm2培养瓶中，在37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.2.3细胞生长曲线测定取第2～5代BMSCs，按上节方法进行消化、离心、重悬细胞，稀释细胞浓度到5×103个/m1，使用细胞计数板计数。按200 μ1/孔细胞悬液接种至96孔板，分为12组，每组8孔，置于孵箱内培养。以后每日取1组（8孔），吸除废液，加入100 μ1培养液及10 μ1 CCK8溶液孵箱内培养3 h。另取96孔板，从原培养板添加CCK8孔中吸取100 μ1溶液至新96孔板中，使用酶标仪在波长为450 nm处测得OD值，计算每组均值和标准差，使用GraPhPad Prism 5软件绘制以天数为横坐标，细胞均值数为纵坐标的生长曲线。

1.2.4细胞鉴定

1.2.4.1克隆形成取第3代BMSCs并采用细胞计数板计数，以×103个/100 mm培养皿接种细胞，加入10%胎牛血清的培养液至8 m1，于37℃、5%CO2孵箱箱中培养，每2 d换液1次。第14 d后，PBS清洗，2.5%戊二醛固定15 min，之后加入8 m1 0.1%甲苯胺蓝染色15 min，PBS漂洗2次，置于体式显微镜下对细胞克隆形成情况进行计数（＞50个细胞的细胞团记作1个克隆），并计算克隆形成率（克隆形成率＝细胞克隆数÷接种时的细胞数×100%）。以上计数重复3次。

1.2.4.2成脂诱导分化将第3代BMSCs以5× 105个/孔接种细胞于24孔培养板中，待细胞贴壁生长、融合＞90%时，加入脂诱导液（5%FBS的α-MEM培养基，100 nM地塞米松，0.5 mM IBMX，50 mM吲哚美辛，0.01 mg/m1胰岛素，50 μg/m1的抗坏血酸）诱导2 w，每4 d换液1次。2 w后倒置显微镜下观察脂滴形成情况，PBS清洗3次，5 min/次，2.5%戊二醛固定15 min，油红O染色，倒置显微镜下观察拍照。

1.2.4.3成骨诱导分化将第3代BMSCs以5× 105个/孔接种细胞于24孔培养板中，待细胞贴壁生长、融合＞90%时，加入骨诱导液（5%FBS的α-MEM培养基，10 mM β-甘油磷酸钠，50 μg/m1抗坏血酸，100 nM地塞米松）培养，每4 d换液1次。一部分细胞成骨诱导1 w后，采用碱性磷酸酶试剂盒染色，倒置显微镜下观察ALP的形成；其余细胞继续诱导至4 w，茜素红染色漂洗后，倒置显微镜下观察矿化情况并拍照。

2　结果

2.1细胞生长情况及形态初接种的BMSCs一般悬浮于培养液中，2 h后逐渐贴壁生长，1 d时细胞较圆，密集分布（图1A）；37℃、5%CO2孵箱培养3 d后，首次半换液，可见部分细胞呈成纤维细胞样，部分杂细胞仍呈类圆形（图1B）；培养5 d全换液后，BMSCs开始集落，多数呈成纤维细胞样，仍有少量杂细胞（图1C）；培养10 d后，杂细胞基本消失，细胞呈较为均匀的成纤维细胞样，紧贴培养瓶壁生长，长满90%左右，可进行传代培养（图1D）。继续传代得到第2、3代细胞，纯化的细胞呈现均一的成纤维细胞样，旋涡状或辐射状整齐有序排列，即可用于实验。

2.2细胞生长曲线采用CCK8法测定细胞生长曲线，如图2所示，生长曲线呈“S”形，前1～2 d细胞生长缓慢，处于生长潜伏期；自第3 d起，细胞进入快速增殖期，并在第7 d达到增殖平台期，细胞数目增长趋于平缓。

图2　第3代BMSCs的生长曲线

2.3细胞鉴定BMSCs低密度接种，37℃、5% CO2培养14 d，可见集落样生长的细胞克隆团块（图3A），克隆形成率为（22.5±2.9）%。使用成脂诱导液诱导成脂分化2 w后，油红O染色，可见细胞内及细胞间分布着红色脂滴（图3B）。使用成骨诱导液成骨诱导1 w后，可见细胞内蓝色结晶（图3C）；使用成骨诱导液成骨诱导4 w后，经茜素红染色后，可见形成不规则的红色矿化结节（图3D）。

3　讨论

BMSCs属于多能或全能基质干细胞，具有分化为多种细胞的潜能，如成骨细胞、脂肪细胞等，在形态上其与成纤维细胞相似。目前常用体外分离纯化培养大鼠BMSCs的方法主要包括全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪法、特制培养板筛选法和免疫磁珠法等[1]。从综合各个方面考虑，全骨髓贴壁培养法较为常用、且操作相对简易。

全骨髓贴壁法即取自动物股骨和胫骨的全骨髓加入培养液中培养，接种3 d后半换液。也有研究表明延长首次换液时间有利于细胞的贴壁和增殖，因为不贴壁细胞分泌的细胞因子可能对于干细胞的生长有促进作用，首次换液时间最长可在7～10 d进行[2]。首次换液后，每2 d换液1次，细胞长满80%～90%即可首次传代。本实验采取贴壁离心法，操作简易，需要实验仪器设备较少，BMSCs制备纯度也较高。

CCK8是一种检测细胞存活和生长的常用方法，具有灵敏度高、重复性好、操作简便等特点[3]。通过CCK8检测SD大鼠BMSCs的生长曲线，表明分离纯化培养的SD大鼠BMSCs具有一定的增殖能力和自我更新能力[4]。从细胞生长曲线看，全骨髓贴壁法培养的SD大鼠BMSCs增殖迅速、生长曲线良好，证明获得的SD大鼠BMSCs具有很好的增殖能力，活性很强。

图1　SD大鼠BMSCs不同培养时间生长情况A：培养1d；B：培养3d；C：5d；D：10d

图3　BMSCs的克隆形成及体外多向分化潜能鉴定

克隆形成鉴定是BMSCs研究中的常用方法，主要原理是将细胞分离成单细胞悬液，然后接种培养基，根据集落形成数量和大小来判断细胞增殖能力和群体依赖能力[1，6-7]。同时，多向分化潜能也是BMSCs的重要特征。本实验通过体外成脂、成骨诱导对SD大鼠BMSCs多向分化潜能进行鉴定，结果发现成骨诱导后，成骨早期指标之一的碱性磷酸酶染色呈强阳性，证明分离培养的SD大鼠BMSCs开始向成骨细胞转化；而成骨诱导4 w后经过茜素红矿化染色发现，钙化结节染色呈强阳性，出现了典型的成骨细胞特性，表明SD大鼠BMSCs具有成骨分化潜能。在成脂诱导2 w后，细胞胞浆及细胞间发现脂滴，油红O染色出现明显红色脂滴，证实分离培养的SD大鼠BMSCs开始向成脂细胞转化。

综上所述，本实验分离、纯化培养的SD大鼠BMSCs是符合实验要求的具有自我更新和增殖能力，以及多向分化潜能的干细胞，可为相关实验研究提供依据。

【参考文献】

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Cu1tiVation，dePuration and identification of SD rats' bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s

Luan Haiyan1，Li Guangwen2，3，Li Hui4，Wang Jun6，Xin Yue2，Yang Chaoyan5，Tian Qing3，He Wei3，Qi Zhiyuan6，Cao Sizhang3，Lü Botao6，Pei Yongquan7，Liang Zheng6，Cheng Shuo6

1. B1ood Center of Yantai City，Yantai，Shandong，264000，China；2. State Key Laboratory of Mi1itary Stomato1ogy，Co11ege of Stomato1ogy，the Fourth Mi1itary Medica1 UniVersity，Xi'an，Shaanxi，710032，China；3. Unit 96617 of PLA，Luzhou，Sichuan，646000，China；4. DePartment of EPidemio1ogy and Hea1th Statistics，West China Schoo1 of Pub1ic Hea1th，Sichuan UniVersity，Chengdu，Sichuan，610041，China；5. DePartment of Pediatrics，PeoP1e's HosPita1 of Luzhou City，Luzhou，Sichuan，646000，China；6. HosPita1 537 of PLA，Baoji，Shaanxi，721006，China；7. Unit 96411 of PLA，Baoji，Shaanxi，721006，China

[Abstract]ObjectiVe To exP1ore the cu1tiVation，dePuration，and identification methods of SD rats' bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s（BMSCs）in Vitro. Methods Necks of one-week-o1d SD rats were taken off for death，their hind 1imb femurs and tibias on both sides were striPPed in order to abstract BMSCs. Who1e bone marrow adherent method was used to seParate，cu1ture，and Purify BMSCs. Ce11 morPho1ogic changes were obserVed，and the growth curVe was drawn. The identification was carried out by the methods of osteogenic and adiPogenic induction and c1oning efficiency. Resu1ts SD rats' BMSCs grew raPid1y，and the growth curVe was good. Through the methods of osteogenic and adiPogenic induction and c1oning efficiency，those ce11s were identified as SD rats BMSCs. Conc1usion Who1e bone marrow adherent method is an effectiVe way to seParate，Purify，and cu1ture the BMSCs，which can raPid1y obtained the Primary ce11s with better Pro1iferatiVe caPacity for exPeriment and research use.

[Key words]bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11；Primary cu1ture；Purification；rat

收稿日期：（2015-08-12）

通讯作者：李广文，电话：029-84776159；E-mai1: fes1gw_4138@ 163.com

基金项目：军事口腔医学国家重点实验室开放课题资助项目（2014KB11）

文章编号1004-0188（2016）02-0117-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2016.02.001

中图分类号R 329.2

文献标识码A

作者单位：264000山东烟台，烟台市中心血站（栾海燕）；军事口腔医学国家重点实验室、第四军医大学口腔医学院（李广文，辛越）；解放军96617部队（李广文，田青，何伟，曹思樟）；四川大学华西公共卫生学院流行病与卫生统计学系（李卉）；泸州市人民医院儿科（杨朝艳）；解放军537医院（王军，齐志远，吕波涛，梁政，程硕）；解放军96411部队（裴永泉）