电针对颈椎病大鼠椎间盘软骨细胞及PI3K/Akt信号通路的影响*

童秀冰，郑佳璇，廖 军，黄萍萍，郑春水

(福建中医药大学针灸学院，福州 350122)

电针对颈椎病大鼠椎间盘软骨细胞及PI3K/Akt信号通路的影响*

童秀冰，郑佳璇，廖 军△，黄萍萍，郑春水

(福建中医药大学针灸学院，福州 350122)

目的:探讨电针在颈椎病大鼠模型椎间盘软骨细胞的凋亡，以及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/ Akt)信号传导通路中的两个蛋白PI3K、Akt的影响。方法:将40只SD大鼠按随机数字表法分成电针组、莫比可组、假手术组、模型组4组各8只，雌雄各半。电针组给予“颈夹脊”、“手三里”穴治疗25 min/d/次，14 d为1个疗程共2个疗程，中间休息2 d;莫比可组用莫比可进行灌胃处理;模型组、假手术组无任何治疗只做固定，其治疗疗程同电针组。疗程结束，取大鼠颈部椎间盘组织测生化相关指标。结果:电针治疗后可见颈椎病大鼠模型软骨细胞中PI3K、P-Akt、Bcl-2的蛋白含量表达上升且幅度大，Bax的表达则出现抑制。结论:电针能延缓颈椎病大鼠椎间盘软骨细胞的凋亡过程，其机制与PI3K/Akt信号传导通路与Bcl-2、Bax的含量可能有关。

电针;颈椎病;软骨细胞凋亡;PI3K;AKT

颈椎病是临床常见疾病，颈椎病发生病理改变，究其根本的原因是椎间盘的退变［1］。诸多研究［2-3］认为，椎间盘退变始发于软骨细胞的凋亡，也因此使得细胞分泌胞外基质的功能退化，从而加速了椎间盘退行性变的发生，通过对软骨细胞的凋亡进行干预，在治疗椎间盘退行性相关疾病方面有一定的意义［4］。在颈椎病的治疗中，电针是很有优势的方法之一，本实验复制颈椎病大鼠的模型，观察电针在软骨细胞凋亡和PI3K/Akt的表达中起调控作用，进而探究在椎间盘退变过程中相关因子可能起到的作用。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(100 g ±20 g)(上海斯克莱)，大鼠适应性喂养7 d。

1.2 主要药物、试剂及仪器

莫比可片(扬子江药业);苯甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、Tris-HCL、Loading buffer、甘氨酸、Tris、TBST、二抗(碧云天); Bradford试剂盒(南京凯基);SDS、过硫酸胺、TEMED、二硫苏糖醇(美国BIO-RAD);蛋白marker (Fermentas);一抗(PI3K、P-Akt、Akt，Cell Signaling Technology);二抗(Bax、Bcl-2，北京博奥森);电针仪(华佗牌);酶联免疫检测仪(上海中庸);移液器(德国EPPENDORF);AB204-N电子天平(梅特勒公司);脱水机(亚光医用公司);BIO RAD凝胶成像分析仪(美国BIO-RAD公司);MDF-D5410低温冰箱(日本三洋);LDZ5-2离心机(北京离心机厂)。

2 方法

2.1 分组及造模

采用随机数字表法在40只大鼠中选出10只作为假手术组，其余为造模组，每组中雌雄各半。根据王拥军［5］等文献资料造模，10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。备皮并在大鼠颈背的正中间做一纵向手术切口，长度控制在2 cm，钝性分离各层组织，横向破坏右侧肌肉和韧带最后缝合。假手术组仅将皮肤切开、缝合，不需其他处理。术后正常饲养3个月，每组取出1只大鼠，HE染色及Toluidine blue染色用以确定造模是否成功［6］。课题前期研究提示，在TUNEL染色中模型大鼠椎间盘的细胞程序性死亡显著高于假手术组［7］。模型复制成功，雌雄各半随机分为电针组、莫比可组、假手术组、模型组，每组8只。

2.2 动物干预

2.2.1 电针组 模型大鼠成功后选颈夹脊、手三里穴位(两侧)，治疗时每次取同侧，穴位参照《实验针灸学》［8］，双侧交替进行电针治疗。具体如下:固定大鼠后针刺上述两穴(用Φ0.3×15 mm华佗牌针灸针，深度4 mm左右)并连接电针仪，疏密波(2/ 100 Hz)，强度以局部轻微抖动为佳，25 min/d，1个月疗程14 d，共2个疗程，疗程间休息2 d。

2.2.2 莫比可组 造模成功后用莫比可灌胃治疗，每日1次，按照0.75 mg/kg的标准［9］做到时间相对固定，于上午8～10点进行，每周1次大鼠体质量监测以调整药物剂量，疗程同电针组。

2.2.3 假手术组、模型组 无其他治疗，只作固定处理，治疗疗程同电针组。

2.3 动物取材

干预疗程结束后即采集标本。以5 ml/kg的计量参照标准，用10%的水合氯醛对大鼠行麻醉处死，开始钝性分离颈项部各层组织，并取下所需的颈椎间盘节段，用PBS冲洗并逐一标记，迅速放入已经备好的液氮罐里，再转入－80℃的冰箱储存。

2.4 免疫组化法检测Bax和Bcl-2表达

石蜡切片并脱蜡，将枸橼酸缓冲液用微波炉加热沸腾，玻片放入其中焖5 min再加热1 min，再焖5 min取出后冷却至常温;PBS浸泡3 min，反复3次，加3%H2O2反应10 min;同上滴加封闭液;载玻片上加一抗(Bax和Bcl-2浓度均为1∶100)于4℃冰箱过夜;次日将玻片置于常温回温1 h后用PBS浸泡5 min，反复3次，加入二抗进行反应10 min;然后用PBS反复浸泡3次，每次5 min，加入过氧化物酶并在室温反应10 min后取出;最后是用DAB进行显色，苏木精染色，常规条件下脱水进行透明并封片，镜下观察结果。

2.5 Western Blot检测

将颈椎间盘组织按照实验试剂说明书，经蛋白提取、裂解和离心后得组织总蛋白产物，蛋白浓度测定(Bradford法);配胶后进行电泳然后转膜，在5%脱脂牛奶里加入 PVDF膜在室温下摇床反应30 min;加一抗，兔抗大鼠PI3K(浓度1∶2000)、兔抗大鼠Akt(浓度1∶2000)、兔抗大鼠 P-Akt(浓度1∶1500)，并放置4℃冰箱摇床过夜，次日用1×TBST缓冲液冲洗10 min，反复3次;加二抗，山羊抗兔(浓度1∶2000)进行摇床反应至2 h，冲洗同上;膜上加入AB混合液显色，最后用图像分析软件分析相应蛋白表达情况。

2.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，全部资料以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Bax、Bcl-2的组间表达分析

图1、2表1显示，大鼠颈椎间盘软骨细胞内有Bax、Bcl-2的表达，呈棕黄色阳性反应。从每组阳性细胞数量及阳性蛋白表达来看，模型组与假手术组比较，Bax阳性蛋白表达升高(P＜0.05);电针组、莫比可组与模型组比较，Bax阳性蛋白表达显著下降(P＜0.05);Bcl-2阳性蛋白表达在假手术组最高，电针组、莫比可组次之，3组与模型组比较差异有统计学意义。

图1 Bax蛋白含量的表达比较分析图(免疫组化×400)

表1 各组大鼠软骨细胞Bax和Bcl-2比较(±s)

表1 各组大鼠软骨细胞Bax和Bcl-2比较(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05

组 别 鼠数Bax Bcl-2假 手 术 组 8 6.63±2.13* 21.88±10.41*模 型 组 8 17.25±7.87 11.50± 4.66电 针 组 8 10.75±3.41* 20.75± 8.43*莫 比 可 组 8 11.09±5.95* 20.38± 7.65*

3.2 PI3K、P-Akt(Ser473)、Akt蛋白表达分析

图3表2显示，电针组、莫比可组及假手术组较模型组PI3K蛋白表达量均上升，差异有统计学意义。

图2 Bcl-2蛋白含量表达比较分析图(免疫组化×400)

P-Akt表达显示，电针组、莫比可组及假手术组较模型组P-Akt的蛋白表达量均上升，差异有统计学意义。Akt表达显示，每个组别之间Akt蛋白含量的表达无明显差异。

图3 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表达比较

表2 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表达比较(±s)

表2 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表达比较(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05，#P＞0.05

组 别 鼠数 PI3K P-Akt(Ser473)Akt假手 术 组 8 0.94±0.12* 1.06±0.25* 0.94±0.12#模 型 组 8 0.51±0.19 0.63±0.16 0.97±0.16电 针 组 8 0.82±0.13* 0.89±0.14* 0.94±0.17#莫比 可 组 8 0.81±0.15* 0.89±0.25* 0.97±0.18#

4 讨论

PI3K/Akt通路被命名为“抗凋亡途径”，多数专家学者肯定其作为软骨细胞存活的重要通路作用。PI3K属于胞内磷脂酰肌醇激酶，具有蛋白、脂类激酶的活性，当酪氨酸激酶受体或G2蛋白耦联受体将其激活后，可产生胞内信使(PIP2及PIP3)，由此对细胞增生、凋亡及代谢等发挥重大作用［10］。PIP3与Akt相结合即磷酸化启动，且Akt中Ser473位点之磷酸化是作为Akt最终活化的标志。PI3K/Akt通路被激活后，使得Akt迅速活化，并进一步磷酸化丰富的下游靶点，如核因子κB(NF-κB)、Bax、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、Survivin以及Forkhead转录因子家族成员FKHRL1，这些因子让Bcl-2转录的能力增强，产生抗细胞程序性死亡的作用。Ulicietal［11］发现，添加PI3K抑制剂组的胫骨生长较另一组速度显著缓慢，软骨细胞程序性死亡的数量明显增多，提示此途径如果在正常情况下的表达能够有效对抗软骨细胞凋亡。本次实验中，模型组软骨细胞的PI3K、P-Akt相对假手术组的蛋白含量表达呈现下降趋势，电针后软骨细胞中的PI3K、P-Akt蛋白含量表达上升，Akt蛋白含量的表达在组间未见明显差异。若Akt未经磷酸化，PI3K/Akt无法激活，则Akt无法通过调控其下游因子，进而影响细胞存活。由此暗示电针后Akt磷酸化、PI3K/Akt激活在调控软骨细胞程序性死亡过程中有相当重要的地位。

Bax和Bcl-2是PI3K/Akt信号途径上的2个关键因子，它们作用于细胞的凋亡，并发挥各自的调节功能。其中Bax促进细胞凋亡，而Bcl-2通过拮抗Bax使半胱氨酸蛋白酶的激活被阻断，从而抑制凋亡的进行［12］。马春辉等［13］认为，软骨细胞的程序性死亡是骨关节炎性疾病的诱因之一，并观察到Bax蛋白表达在炎性关节软骨中的含量明显升高，认为Bax和Bcl-2共同参与该类疾病的调控。在此次实验中，模型组Bax蛋白含量明显升高，软骨细胞的凋亡数量明显;电针组、莫比可组与模型组比较其蛋白的表达量下降，Bcl-2的表达情况则与之相反，说明电针对大鼠颈椎病软骨细胞程序性死亡的调控与Bax、Bcl-2这对因子密切相关。

莫比可片作为非甾体镇痛、消炎用药，是临床医生治疗颈椎病的常用手段。电针亦可发挥抗炎、镇痛效应、调节机体的整体机能和肌张力、加快循环等作用［14］。在颈椎病的治疗中，临床常选用手三里、颈夹脊穴。颈夹脊在督脉与足太阳经之间循行，督脉统领着人身之阳气，是人体的阳脉之海。足太阳经为人体最长的经脉，电针颈夹脊既通调督脉又调人之阴阳，故而颈部气血疏通为医治颈椎病之根本。现代医学证实，颈夹脊穴其下富含血管、神经、肌肉等，施刺该处能加快血行，进而改善病患肌肉强硬。手三里归属手阳明经，该经阳气最为盛实且多气多血，施刺该穴即可振奋阳气、促进血行;且从经络的走向来看，其经过颈部，正如《灵枢·经脉》记载:“大肠手阳明之脉……上肩……上出于柱骨之会上。”

综上可知，电针施治可使颈椎病大鼠软骨细胞中的Bcl-2、PI3K、P-Akt蛋白表达含量显著上调，使Bax蛋白表达含量下调。从分子生物学角度出发，结合蛋白表达情况的差异化对比，认为电针在治疗椎间盘退变的过程中，可能与PI3K/Akt信号传导路径的激活，并发挥相关调节因子如Bax、Bcl-2的含量相关。但我们此次实验未对其他相关分子机理深入探究，后续实验开展会进一步完善。

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Effects on electroacupuncture of intervertebral disc cartilage cells in the cervical spondylosis rat model and PI3K/Akt signal pathway

TONG Xiu-bing，ZHENG Jia-xuan，LIAO Jun△，HUANG Ping-ping，ZHENG Chun-shui
(Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China)

Objective:To discuss the effect on electro-acupuncture(EA)in the intervertebral disc cartilage cells apoptosis and phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) and serine threonine kinas(AKT)in the rats with cervical spondylosis．Methods:40 SD rats were divided into four groups randomly，including control，model，EA and mobbic groups，male and female half，only 8 for each group．The EA rats were treated with EA on the cervical Jiaji and Shousanli points，25 minutes every day，14 days were one treatment course．The mobbic rats were treated with moby．The control and the model rats were fixed without any treatments．All rats shared the same treatment time．After the courses，the cervical intervertebral disc were detected to examine biochemical indicators．Results:EA treatment on rats of cervical spondylosis could improve the expression of PI3K and P-AKT and Bcl-2，at the same time，reduce the content of Bax．Conclusion:EA treatment can delay intervertebral disc cartilage cell apoptosis in the rats with cervical spondylosis，and the mechanism may be associated with PI3K/AKT signal pathway．

Electroacupuncture;Cervicas spondylosis;Chondrocytes apoptosis;PI3K;AKT

R245．9+7

B

1006-3250(2016)09-1232-04

2016-03-11

国家自然科学基金资助项目(81273836，81001554)

童秀冰(1989-)，女，福建龙岩人，医学硕士，从事针灸推拿治疗脊柱疾病的基础与临床研究。

△通讯作者:廖 军(1977-)，男，重庆合川人，副教授，医学博士，从事中医药防治脊柱疾病的临床与研究，E-mail: 77liaojun@163．com。