华北大黑鳃金龟幼虫肠道菌的分离及对农药的降解

孙勇++曹小迎+++蒋继宏++张先道

摘要：采用4种培养基对金龟幼虫肠道内微生物进行分离培养，并通过16S rRNA测序进行初步鉴定，将分离获得的菌株接种于含辛硫磷和毒死蜱的基础盐培养基上，初步测定对肠道内微生物降解农药的能力。结果表明，选用的4种培养基中，淀粉-酪素培养基获得的微生物数量最多，羧甲基纤维素钠培养基次之，甘油天门冬氨酸培养基最差。对13株有代表性的菌株进行测序分析，初步鉴定这些微生物分属9个属，在分离筛选的菌株中随机挑选供试的28株菌株中，在以毒死蜱（浓度100 mg/L）为唯一碳源的基础盐培养基中，能形成菌落的菌株为8株，在以辛硫磷为唯一碳源的基础盐培养基中，能形成菌落的菌株为19株，表明肠道中有一些微生物对农药有降解作用，其中对辛硫磷降解作用优于毒死蜱，说明在防治华北大黑鳃金龟时，毒死蜱防治效果可能优于辛硫磷。

关键词：华北大黑鳃金龟；肠道微生物；分离；农药降解

中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0151-03

收稿日期：2015-03-26

基金项目：江苏师范大学省药用植物生物技术实验室开放课题（编号：KLBMP1305）。

作者简介：孙勇（1977—），男，江西高安人，硕士，讲师，从事应用微生物学研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蒋继宏，教授。Tel：（0516）83403515；E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。我国农药使用技术水平和农药的利用率都比较低，而更多的农药在施用后则进入了土壤、水体和空气中，对非靶标生物和各个生态因子产生了严重影响，最终导致了农产品品质低劣和农药残留超标[1-2]。长期大量使用农药使害虫产生一定的抗药性，因此要想杀死害虫就得加大药量，害虫的抗药性不断增强，农药使用量不断加大，就会形成恶性循环，环境污染问题日益严重，国家环保局也发布：农药残留污染已被列为环境污染重点治理的工程之一，因此解决农药污染问题势在必行。生活在这些农药环境中的微生物，为了自身生存，与这些污染源一直在进行着斗争，随着时间的推移，它们之间形成了一种协同进化关系，这些微生物具备了降解和利用这些污染源的机制。农药生物修复是利用特定的生物吸收、转化、清除或降解农业生态环境中农药污染，实现农业生态环境净化、生态功能恢复的生物措施。而且已有大量研究表明细菌、真菌、放线菌、藻类等微生物对农药有很好的降解作用[3-10]，它们大多数来自土壤微生物类群。华北大黑鳃金龟为鞘翅目鳃金龟科昆虫，分布在我国东北、华北、西北等地区，主要危害杨、柳、榆、桑、核桃、苹果、刺槐、栎等林木叶片，幼虫危害阔、针叶树根部及幼苗；幼虫栖息在土壤中，取食萌发的种子，造成缺苗断垄；将根茎、根系咬断，使植株枯死，且伤口易被病菌侵入，引起其他病害发生。华北大黑鳃金龟幼虫生活在土壤中，且长期接触化学农药（辛硫磷和毒死蜱是常见的用来杀灭大黑鳃金龟的化学农药），肠道内可能含有一些能降解农药的微生物，因此我们分离了华北鳃金龟幼虫肠道中微生物，采用16S rRNA序列分析进行了初步鉴定，并就农药降解能力进行了初步筛选。

1材料与方法

1.1供试材料

华北大黑金龟鳃幼虫：取冬眠期幼虫。

1.2培养基

TNYE培养基：酵母膏 0.25 g，K2HPO4 0.5 g，琼脂 15.0 g，pH值为7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值7.2。

淀粉-酪素培养基：葡萄糖5 g，可溶性淀粉5 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，CaCO3 2 g，琼脂15 g，pH 值 7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值7.2。

甘油天门冬氨酸培养基：甘油10 g，L-天冬氨酸1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.1 g，琼脂15 g，pH值 7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值 7.2。

羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠20.0 g，磷酸氢二钠2.5 g，磷酸二氢钾1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，琼脂15.0 g，水1 L，pH值7.2。

ISP2培养基：酵母提取物4 g，麦芽提取物10 g，葡萄糖 4 g，水1 L，琼脂15 g，pH值7.2。

LB培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，pH值7.0。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，20 g琼脂，1 L水。

基础盐培养基：

NaCl 1.00 g，NH4NO3 1.00 g，K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.10 g，水1 L，pH值7.0。

1.3金龟幼虫肠道微生物的分离

清洗5支试管，每支试管注入10 mL蒸馏水，加上试管塞，用高温灭菌锅121 ℃灭菌20 min，取出后使其冷却至室温，并标上编号为1、2、3、4、5。打开无菌操作台进行紫外灭菌。选取冬眠的金龟幼虫放入75%的乙醇中浸泡2 min，在无菌操作台上取出虫体放在培养皿中无菌解剖。取少量肠道里白色物质，放入标号为1的试管，然后盖上试管塞摇晃使微生物分布均匀，取出后在无菌操作台上进行梯度稀释。从稀释103倍和104倍的菌液中取50 μL，分别滴入供分离用的培养基中（分离培养基：TNYE培养基，淀粉-酪素培养基，甘油天门冬氨酸培养基，羧甲基纤维素钠培养基），涂布均匀，把培养皿倒置放入恒温保温箱内30 ℃培养8 d。观察菌落生长情况，统计菌落数，并挑取部分菌株转接于试管中保存。

1.4部分分离菌株的初步鉴定

通过测定16S rRNA 基因序列进行初步鉴定，分离菌株总DNA 的提取参照文献[11]的方法进行，PCR 扩增采用细菌16S rRNA 通用引物（27F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1492R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）。PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共35 个循环，72 ℃ 10 min。PCR 产物用经EB 染色的0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后测序。依照测序结果，从NCBI （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）数据库中调出相似性较高相关菌株的16S rRNA基因序列，进行序列比对分析。

1.5降解辛硫磷和毒死蜱菌株的筛选

配制含辛硫磷和毒死蜱有效成分100 mg/L基础盐培养基，将分离获得的菌株接种于培养基上，置于28 ℃ 恒温培养箱中培养，生长状况良好（能形成菌落）的即定为可降解菌。

2结果与分析

2.1各培养基菌株分离情况

由表1可知，选用的4种培养基培养微生物，淀粉-酪素培养基获得的微生物数量最多，0.5 g湿样/mL在稀释103倍下平板菌落数162个，稀释104倍下获得菌落数36个，羧甲基纤维素钠培养基次之，甘油天门冬氨酸培养基最差，在稀释103倍下平板菌落数为30个。

2.2分离获得的菌株种类情况

从各种培养基中共挑取菌株65株，细菌保存于含LB培养基斜面试管中，放线菌保存于含ISP2培养基斜面试管中，从65株菌株挑取了13株有代表性的菌株进行测序分析，由比对结果（表2）可知，幼虫肠道微生物至少包括原小单孢菌属（Promicromonospora）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、冢村氏菌属（Tsukamurella）、壤霉菌属（Agromyces）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、詹森菌属（Janthinobacterium）、小单孢菌属（Micromonospora）、链霉菌属（Streptomyces）等9个属。

2.3肠道微生物对2种农药的降解情况

挑选部分获得的菌株，进行降解毒死蜱和辛硫磷的试验，结果见表3。

供试的28株菌株中，在以毒死蜱（浓度100 mg/L）为唯一碳源的基础盐培养基中，能形成菌落的菌株为8株，占供试菌株28%，在以辛硫磷为唯一碳源的基础盐培养基中，能形成菌落的菌株为19株，占供试菌株67.8%，对毒死蜱和辛硫磷都能降解的有CH1、CH19、CH32、CH33、CH44、CH47（Sac

3讨论

华北大黑鳃金龟幼虫肠道微生物的分离试验选用的4种培养基中，淀粉-酪素培养基分离效果最好，甘油天门冬氨酸培养基分离效果最差。因此，在做肠道微生物分离试验时建议使用淀粉-酪素培养基。

通过研究表明，一些肠道微生物对农药有降解作用，本试验中，华北大黑鳃金龟幼虫肠道微生物对辛硫磷降解作用优于毒死蜱，说明在防治华北大黑鳃金龟时，毒死蜱防治效果可能优于辛硫磷，肠道微生物的降解作用可能是昆虫产生抗药性的原因之一。在农药降解上，微生物菌剂的使用也可能导致害虫获得有分解农药的菌株，为防止用药量上的恶性循环，建议使用具有降解农药菌株的代谢产物进行农药降解，而不应直接使用微生物菌体。

参考文献：

[1]杨新玲. 2011年我国农药产量情况[J]. 农药学学报，2012（1）：50.

[2]王永杰，李顺鹏，沈标. 有机磷农药乐果降解菌的分离及其活性研究[J]. 南京农业大学学报，2001，24（2）：71-74.

[3]张韩杰，闫艳春. 农药残留及微生物在农药降解中的应用与展望[J]. 湖北植保，2004（1）：31-35.

[4]虞云龙，樊德方，陈鹤鑫. 农药微生物降解的研究现状与发展策略[J]. 环境科学进展，1996（3）：28-36.

[5]崔中利，李顺鹏. 化学农药的微生物降解及其机制[J]. 江苏环境科技，1998（3）：1-5.

[6]仪美芹，王开运，姜兴印，等. 微生物降解农药的研究进展[J]. 山东农业大学学报：自然科学版，2002，33（4）：519-524.

[7]魏敏，李玉江. 微生物降解土壤残留农药的研究进展[J]. 山东化工，2007，36（3）：15-18.

[8]程国锋，李顺鹏，沈标，等. 微生物降解蔬菜残留农药研究[J]. 应用与环境生物学报，1998（1）：82-85.

[9]Spychala J，Datta N S，Takabayashi K，et al. Cloning of human adenosine kinase cDNA：Sequence similarity to microbial ribokinases and fructokinases[C]//Proc.Natl，93.Sci.USA，1996：1232-1237.

[10]Müller C W，Schlauderer G J，Reinstein J，et al. Adenylate kinase motions during catalysis：an energetic counterweight balancing substrate binding[J]. Structure，1996，4（2）：147-156.

[11]姜淑梅，张龙，戴世鲲，等. 一种简单、有效的适于PCR操作的放线菌DNA提取方法[J]. 生物技术，2007，17（1）：39-41.刘楠，闫佳会，姚强，等. 青海省麦类黄矮病发生情况调查[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：154-158.