狭叶柴胡愈伤组织和悬浮细胞成分的UPLC/Q-TOF-MS分析

程玉鹏 ，李天聪，高宁，王博，田蓓蓓，王瑶

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150024)



狭叶柴胡愈伤组织和悬浮细胞成分的UPLC/Q-TOF-MS分析

程玉鹏1 ，2，李天聪1，高宁1，王博1，田蓓蓓1，王瑶1

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150024)

摘要：以柴胡皂苷d(SSd)为检测指标，基于超高效液相色谱联用四级杆串联飞行时间质谱仪(UPLC/Q-TOF-MS)，建立狭叶柴胡愈伤组织及悬浮细胞成分定性分析的方法。采用C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，以0.1%甲酸-乙腈为流动相梯度洗脱，使用ESI离子源，正离子模式下采集数据，结合对照品SSd谱图，分析相关文献数据对照。结果表明：在UPLC/Q-TOF-MS检测下，狭叶柴胡悬浮细胞、细胞发酵液及愈伤组织在洗脱时间为11.22、11.19及11.17 min时均与标准品SSd(11.12 min)有相同的裂解碎片，愈伤组织及悬浮细胞中均含有活性成分SSd。相比传统的高效液相检测方法，该方法快速、准确且灵敏度好，适用于柴胡组织培养物中活性成分的检测和分析。

关键词：狭叶柴胡；愈伤组织；悬浮细胞；柴胡皂苷d；UPLC/Q-TOF-MS

狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.为伞形科(Umbelliferae) 柴胡属(BupleurumL.) 多年生草本植物，入药部位是柴胡干燥的根，其主要有效成分为柴胡皂苷类化合物[1,2]。现代药理学研究表明狭叶柴胡具有解热、镇静、抗炎抗菌、保肝利胆、降血压、抗肿瘤及促进免疫功能的作用[3]。 然而柴胡对生长环境要求苛刻，且入药部位特殊(根及根茎)，加之人们过度采挖，使柴胡资源供不应求[4]。因此，有必要考虑开发其他途径来获得更多的柴胡资源以及柴胡中的有效活性成分，以维持其可持续发展。愈伤组织培养技术和植物悬浮细胞培养技术都是现代生物技术开发植物资源的重要手段[5,6]，是保护枯竭中药资源的有效方法[7]。目前通过愈伤组织和悬浮细胞培养提取次生代谢产物进行成分分析在柴胡上还未见报道。课题组前期用HPLC检测狭叶柴胡愈伤组织和悬浮细胞中柴胡皂苷d 时，未能检出柴胡皂苷d。造成这一结果可能是因为植物次生代谢是植物在长期进化中对生态环境适应的过程，其代谢产物是宿主抵御外侵和提高自身抗性的结果，然而，在人工培育过程中其代谢能力减弱，活性成分含量降低，故而不易检测。

色谱具有分离效率高、分析速度快、选择性好、重复性好等优点。质谱具有较高的特异性和检测灵敏度，可提供高分辨率和准确度的数据，能较好捕获色谱峰的准分子离子及碎片离子等信息，有利于色谱峰的鉴定，是中药活性成分研究的最有效的分析手段之一。超高效液相色谱联用四级杆串联飞行时间质谱仪(UPLC/Q-TOF-MS)结合了色谱和质谱的优点，实现时间和空间的在线联用，是一种在定性分析中具有独特优势的联用技术。

本实验对狭叶柴胡悬浮细胞培养的条件进行优化，以建立一个快速生长的稳定的柴胡悬浮细胞培养体系。利用高度灵敏的UPLC/Q-TOF-MS对狭叶柴胡愈伤组织及悬浮细胞的化学成分进行分析，以期利用植物组培技术及发酵技术来获取柴胡中的活性成分，并为开发生物药物提供依据。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

柴胡皂苷d对照品(中国食品药品检定研究院)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，氨水(分析纯)，乙醇(分析纯)，甲酸钠(Sigma)，亮氨酸-脑啡肽(Sigma)，自制双蒸馏水等。

超高效液相串联四级杆飞行时间质谱联用仪(美国Waters公司)，MassLynx 工作站(Waters)，分析型色谱柱：美国ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)，0.22 μm溶剂过滤器，AE240型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，HVE-50自动高压灭菌器(日本平山制造有限公司)，Milli-Q超纯水系统(Millipore)。

1.2试剂与仪器

1.2.1愈伤诱导及悬浮细胞的制备

将柴胡种子进行萌发，取下胚轴在附加6-BA 3 mg·L-1，2,4-D 0.1 mg·L-1，KT 0.6 mg·L-1的MS固体培养基上诱导形成愈伤组织，进而将愈伤组织接入MS + 6-BA 2.5 mg·L-1+ 2,4-D 0.1 mg·L-1+KT 0.9 mg·L-1的液体培养基中进行悬浮培养获得稳定的悬浮细胞系。

1.2.2供试品溶液的制备

收集前期培养的愈伤组织及悬浮细胞于60 ℃烘干至恒重，研磨至粉末状，分别精密称取1.0 g装入圆底烧瓶中，加入60 mL 5% 氨水的70%乙醇，80 ℃回流提取2次，每次1 h。滤过，合并滤液。挥干，加甲醇溶解，得供试品。悬浮细胞发酵液用饱和正丁醇萃取两遍，挥去有机溶剂，得残渣，甲醇溶解，得供试品。所得滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.2.3柴胡皂苷d对照品溶液的制备

精密称取柴胡皂苷d 0.012 5 g，用甲醇定容25 mL容量瓶中。配制成0.5 g·L-1的对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3检测条件

1.3.1色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)超高效液相色谱柱，采用正离子模式色谱条件对供试样品进行检测，流动相：A为0.1% 的甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序：0～1 min，2%～10% B；1～4 min，10% B；4～12 min，10%～70% B；12～14 min，70%～98% B；14～15 min，98%～2% B；15～17 min，2% B，流速0.4 mL·min-1，进样量4 μL，柱温40℃。

1.3.2质谱条件

采用Micromass Q-TOF microTM质谱在正离子模式下对样品检测，质谱参数为：电喷雾离子源为ESI源，脱溶剂气流量650 L·h-1，脱溶剂温度为350 ℃，锥孔气流量为50 L·h-1，离子源温度为120℃，正离子模式毛细管电压分别为3.0 kV，锥孔电压25 kV，撞能量6 V，交替进行每0.2 s采集一次谱图，中间间隔0.02 s。锁定质量溶液：亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin, [M+H]+=556.2771, [M-H]-=554.2615)，目的是确保分析的精确性和可重复性，该锁定质量溶液浓度为40 μg·L-1，流速为15 μL·min-1，扫描间隔10 s。样品进样量10 μL，正离子模式下检测，扫描范围100～1 000 Da。

2结果

2.1狭叶愈伤组织及悬浮细胞最优培养条件

前期实验通过使用不同激素不同配比，筛选出愈伤组织诱导和悬浮细胞培养的最佳条件，结果表明：愈伤组织在6-BA 3mg·L-1，2,4-D 0.1 mg·L-1，KT 0.6 mg·L-1的MS固体培养基上生长状态良好。取生长均匀、质地松散的愈伤组织在MS + 6-BA 2.5 mg·L-1+ 2,4-D 0.1 mg·L-1+ KT 0.9 mg·L-1的培养液中进行悬浮培养，获得快速生长的稳定的狭叶柴胡悬浮细胞系(图1)。

图1　愈伤组织及悬浮细胞系Fig.1　Callus and suspension cells

2.2UPLC/Q-TOF-MS对样品化学成分的检测

本实验以柴胡皂苷d为指标对狭叶柴胡愈伤组织、悬浮细胞及其细胞发酵液的代谢产物进行检测。结果表明：悬浮细胞、细胞发酵液及愈伤组织的代谢产物在洗脱时间为11.22、11.19及11.17 min时，与对照品SSd(11.12 min)有相同的裂解碎片，m/z分别为763.44, 455.35和 601.4(图2、图3)。

图2　柴胡皂苷d标准品谱图Fig.2　Spectrogram of the saikosaponin d

图3　样品中的柴胡皂苷d(箭头所指)的阳离子模式总离子色谱Fig.3　Total ion chromatogram of the saikosaponin d in positive mode

3讨论与结论

在愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养过程中，培养基中激素的种类及配比起着关键的作用，不同的激素对植物的刺激效果不同。常用的细胞分裂素是KT和6-BA，生长素是IAA、NAA 和2,4-D[8,9]。根据不同的材料，添加适宜的激素种类和浓度，不仅能够有效的促进植物细胞的增殖分化，也有利于促进植物次生代谢产物的合成。此外，在建立悬浮细胞培养体系过程中，愈伤组织的选择尤为重要，生长均匀、质地松散的愈伤组织为细胞悬浮培养的最佳选择。

狭叶柴胡中含有皂苷、黄酮、多糖、甾醇及挥发油等有效成分，其主要药效成分为柴胡皂苷a与d，其中柴胡皂苷d的药理活性广泛[10,11]，且柴胡提取物中柴胡皂苷d的含量高于柴胡皂苷a的含量[12]，故本实验选择柴胡皂苷d作为检测指标的对照品。柴胡皂苷d属于五环三萜皂苷，其13位和28位形成环氧环结构， 在提取过程易中受酚类或酸性成分的影响，使环氧醚键开环[13]，因而通常采用弱碱性溶剂提取柴胡皂苷可保护氧桥免于水解。由于柴胡皂苷紫外吸收很弱或无紫外吸收，通常利用紫外检测器检测柴胡皂苷的有效波长要低于210 nm，但仍存在吸收较弱和干扰较多的问题[14,15]，飞行时间质谱(Q-TOF)作为检测器可以有效地解决上述问题。此外，课题组前期用HPLC在检测狭叶柴胡愈伤组织和悬浮细胞中柴胡皂苷d 时，发现样品柴胡皂苷d未能检出。这是由于其含量很低，不易检测。相比传统的高效液相系统，超高效液相系统能显著的缩短分析时间，提高分析效率，增强检测灵敏度。故此，本实验所选用的UPLC/Q-TOF-MS能够准确、简便、快速地检测柴胡愈伤组织及悬浮细胞中的柴胡皂苷d。

通过合理的利用植物愈伤组织培养及悬浮细胞培养技术，经不断的优化培养，将会获得更多的植物材料以解决柴胡资源日益紧缺的现状，且利用愈伤组织和悬浮细胞的技术来获取药效活性成分，具有成本低、生产周期短、不受自然条件影响的优势。然而有些植物细胞的生理生化特性还未完全被人们所认识，植物细胞培养体系中普遍存在细胞系不稳定，细胞生长缓慢等特点，而且目标产物含量极低，不易检测[16,17]。UPLC/Q-TOF-MS具有高速采样速度的灵敏检测器，在同样条件下UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多，此外，飞行时间质谱仪可检测的分子量范围大，扫描速度快，TOF-MS在每次进样时，可采集样本中所有的m/z,因此UPLC/Q-TOF-MS能对样本中微少含量的成分进行检测，并同时检测多个碎片离子峰，其结果具有一定的可靠性。目前通过利用UPLC/Q-TOF-MS技术对柴胡愈伤组织和悬浮细胞及细胞培养液的有效成分分析还未见报道。由于多数情况下植物细胞培养合成某些有效成分的能力低且不稳定[18]，因此在后期实验工作中我们将进一步筛选高产细胞系、深入研究活性成分的生物合成途径，以及对培养条件进行优化等。

总之，本实验主要利用UPLC/Q-TOF-MS对狭叶柴胡愈伤组织、悬浮细胞的有效成分进行分析，其乙醇提取物检测结果表明在狭叶柴胡的愈伤组织、悬浮细胞及细胞培养液中均可检测到柴胡皂苷d。这一结果为获取狭叶柴胡药效活性成分，以期为利用植物组培技术开发生物药物提供依据，进而更好的解决柴胡资源短缺的问题，为今后工业化生产奠定基础。

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(编辑：马荣博)

Analysis on compounds of callus and suspension cell ofBupleurumscorzonerifoliumWilld. by UPLC/Q-TOF-MS

Cheng Yupeng1,2, Li Tiancong1, Gao Ning1, Wang Bo1, Tian Beibei1, Wang Yao1

(1．CollegeofPharmacy,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040，China; 2．CollegeoflifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150024，China)

Abstract:To establish the qualitative analysis method using UPLC/Q-TOF-MS for bioactive compound of saikosaponin d (SSd) in callus and suspension cell of Bupleurum scorzonerifolium Willd.. C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column was adopted under the ESI positive mode eluting gradiently with 0.1% formic acid -methyl cyanide. The data were collected and comparatively analyzed with references saikosaponin d and relevant literatures. The results showed that suspension cell, cell supernatant and callus had the same fragments as SSd (11.12 min) at 11.22, 11.19 and 11.17 min, respectively. This indicated that callus and suspension cell can produce SSd. Compared with traditional HPLC method, UPLC/Q-TOF-MS method was quick, precise and highly sensitive, which could be suitable for detection and analysis of bioactive compounds of tissue cultures of B. scorzonerifolium Willd.

Key words:Bupleurum scorzonerifolium Willd.; Callus; Suspension cell; Saikosaponin d; UPLC/Q-TOF-MS

中图分类号：Q813.1； R284.1

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)03-0186-05

基金项目：黑龙江省教育厅基金(12531621)

作者简介：程玉鹏(1966-)，男(汉)，黑龙江哈尔滨人，副教授，博士，研究方向：内生真菌与宿主间的代谢交流。

收稿日期：2015-12-13修回日期：2015-12-30