枯草芽孢杆菌D-29对采后梨褐腐病的抑制效果研究

王丹，姚晓东，郝晓娟，曹挥，李新凤，王建明

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)



枯草芽孢杆菌D-29对采后梨褐腐病的抑制效果研究

王丹，姚晓东，郝晓娟*，曹挥，李新凤，王建明

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

摘要：为探究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)D-29对采后病害的抑制效果，本研究以梨为试验对象，以果生链核盘菌(Monilinia fructigena)为病原菌，通过在果实伤口上接种不同处理的D-29处理液测定其对采后梨褐腐病的抑制效果，监测D-29菌体在果实伤口上数量的动态变化。结果表明，D-29菌悬液可有效降低梨褐腐病的发病率，浓度越大，抑制效果越明显；先接种D-29菌悬液的处理组，果实的发病率明显低于先接种病原菌孢悬液的处理组，对病斑扩展的抑制率明显高于先接种病原菌孢悬液的处理组，且在先接种D-29菌悬液的处理组中，与接种病原菌孢悬液的时间间隔越长，抑菌效果越好；D-29+无菌水及D-29+病原菌孢悬液两种处理下，D-29菌体均能在短时间内在果实伤口上定殖。

关键词：枯草芽孢杆菌；梨；褐腐病；生物防治

果蔬与人们的生活息息相关，其采后病害造成的损失逐渐引起了人们的关注，成为一项亟待解决的问题。目前防治病害侵染的方法有物理防治、化学防治及生物防治，主要以化学防治为主[1]。但化学农药的长期过量使用导致果蔬病原菌抗药性增强及毒物残留量的增加，对生态环境和人畜的健康造成威胁[2,3]。基于对化学杀菌剂日益加剧的限制要求，以及20世纪80年代以来抗病虫害及农作物大田病害生物防治蓬勃发展的带动下，果蔬采后病害的生物防治受到重视，逐渐成为国内外学者的研究热点[4～7]。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类具有生长快、营养简单、产生抗逆芽孢、对人畜无害、对环境友好等突出特征的生防细菌[8]，目前已有多种枯草芽孢杆菌菌剂推向市场[9]。D-29是一株从健康地肤中分离得到的枯草芽孢杆菌，目前已有研究表明其对多种植物病原真菌具有抑制作用[10,11]。本研究将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)D-29应用于采后梨褐腐病的生物防治，以探究该菌株在不同处理下对褐腐病的抑制效果，以及在果实伤口的动态变化，以便为商业化条件下果实的储藏提供一定的依据。

1材料与方法

1.1供试菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)D-29是从健康地肤上分离的一种内生生防细菌，褐腐病原菌果生链核盘菌(Moniliniafructigena)分离于自然发病的梨。二者均由山西农业大学植物病理学实验室保存。

1.2培养基

NA、NB、PDA培养基[12]。

1.3D-29处理液及病原菌孢悬液的制备

将活化后的D-29菌株接种于含30 mL NB培养液的锥形瓶中，于30 ℃ 170 r·min-1摇床培养48 h。发酵液经8 000 r·min-1离心10 min，收集菌体沉淀后用无菌水洗涤，并分别调浓度至106、107、108CFU·mL-1液备用。

挑取试管保存的褐腐病原菌菌株接种于PDA平板，于25 ℃培养7 d，收集孢子并用无菌水重悬稀释至105spores·mL-1备用。

1.4果实的处理

选取大小及成熟度一致的健康梨果实，采用Ting等[13]的方法进行消毒处理。在超净工作台中使用灭菌圆木棒(φ=3 mm)在每个果实腰部人工制造一个大小约3 mm×3 mm的伤口。

第三，改变以往零散经营、松散合作的简单团队协作方式，通过股份合作组建大型商业企业，运行现代企业管理制度。要把众多中小闽商或以行业、或以地域为单位联合起来，组建大型商业企业或商贸城，用现代企业形式实现互助合作共同经营，把闽商的团队协作纳入现代企业管理，建立股权分散但经营权集中的现代企业制度，有利于参与市场竞争，又避免自相竞争。这样，闽商团队协作就上升到现代企业制度和企业文化的高度。这需要政府出面协调运作，从金融服务、科技中介服务、投资环境服务、公共服务等多方面入手，整合闽商力量。

1.5拮抗菌D-29最适拮抗浓度的测定

分别在果实伤口处加20 μL浓度为106、107、108CFU·mL-1的D-29菌悬液，以等量无菌水为对照(CK)，待液体晾干后再分别滴加20 μL浓度为105spores·mL-1病原菌孢悬液。对处理完成后的果实做好保湿措施，并于25 ℃下恒温储藏，4 d后观察记录果实的发病情况，并采用十字交叉法测量病斑直径。每处理6个果实，各做3次重复，该试验重复两次。

果实发病率/%=每组果实发病的数量/该组果实的总数×100。

病斑扩展抑制率/%=(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100。

1.6接种时间对拮抗菌D-29抑菌效果的影响

该试验分两组，一组为先接种20 μL浓度为108CFU·mL-1的D-29菌悬液于果实伤口，分别经2、12、24 h后再接种20 μL浓度为的105spores·mL-1病原菌孢悬液；另一组为先在果实伤口上接种20 μL 105spores·mL-1病原菌孢悬液，分别经2、12、24 h后再接种20 μL浓度为108CFU·mL-1的D-29菌悬液。以无菌水为对照。储藏方法及观测依据同1.5。每处理6个果实，各做3次重复，该试验重复两次。

1.7拮抗菌D-29在果实上伤口处的动态变化测定

处理一为20 μL 108CFU·mL-1的D-29菌悬液+20 μL无菌水，处理二为20 μL 108CFU·mL-1的D-29菌悬液+20 μL 105spores·mL-1病原菌孢悬液。两种液体滴加的时间间隔为2 h。储藏方法同1.5。分别于0、12、24、36、48、72和96 h时随机取样测定菌体数量。测定方法参照Wojciech[14]等的方法。每次随机抽取5个果实，该试验重复3次。

1.8数据处理

采用SPSS 20.0软件对试验所得数据进行方差分析(P=0.05)，采用Microsoft Excel 2003软件作图。

2结果与分析

2.1D-29不同浓度对梨褐腐病的抑制效果

由表1可知，和无菌水对照组相比，随着D-29浓度的增加，梨褐腐病的发病率降低，病斑扩展抑制率升高。当浓度为106CFU·mL-1和107CFU·mL-1时，果实发病率分别为53.9%、34.9%，病斑扩展抑制率分别为65.2%、76.6%；当浓度为108CFU·mL-1时，果实发病率最低，仅为4.55%，病斑扩展抑制率高达98.6%。由此可见，108CFU·mL-1D-29菌悬液的抑菌效果最佳。

2.2D-29不同接种时间对梨褐腐病的抑制效果

在接种病原菌孢悬液前2 h和12 h分别接种D-29菌悬液，果实发病率分别为4.8%、4.7%，病斑扩展抑制率分别为97.9%、98.9%，这两个时间间隔处理下的果实发病率和病斑扩展情况之间均无明显差异(P<0.05)。但与对照组相比，果实发病率明显降低，且能效控制病斑的扩展；前24 h接种D-29菌悬液，可完全控制病害的发生。在接种病原菌孢悬液后2、12和24 h分别接种D-29菌悬液，果实发病率分别为35.7%、64.3%、79.4%，病斑扩展抑制率分别为88.7%、78.9%、42.7%。整体来看，在相同的时间间隔下，先接种D-29菌悬液的处理组，果实发病率明显低于先接种病原菌孢悬液的处理组，对病斑扩展的抑制率明显高于先接种病原菌孢悬液的处理组(P<0.05)(表2)。

表1不同浓度的D-29菌悬液对梨褐腐病的抑制效果

Table 1Inhibitory efficacy of different concentration of D-29 on brown rot of pears

D-29菌悬液浓度ConcentrationofBacillussubtilisD-29发病率/%Diseaserate病斑扩展抑制率/%InhibitionrateoflesionexpansionCK100a-1×106CFU·mL-153.9±11.1b65.2±9.1b1×107CFU·mL-134.9±4.2b76.6±3.5b1×108CFU·mL-14.55±4.7c98.6±3.9a

表2拮抗菌D-29不同接种时间对梨褐腐病的抑制效果

Table 2Inhibitory efficacy of different inoculation time of D-29 on brown rot of pears

不同的接种时间间隔IntervaltimeofinoculationofD-29andpathogen发病率/%Diseaserate病斑扩展抑制率/%InhibitionrateoflesionexpansionCK100a-D-29先于病原菌2h4.8±0.8de97.9±11.3a12h4.7±0.8de98.9±6.4a24h0e100a病原菌先于D-292h35.7±18.9cd88.7±9.6ab12h64.3±19.3bc78.9±4.8b24h79.4±10.1ab42.7±4.7c

2.3D-29在果实伤口处的数量动态结果

D-29菌体数量的动态变化如图1所示。处理一(D-29+无菌水)菌体D-29的数量在0～12 h内迅速上升，12 h时菌体数量达为4.7×107CFU，是0 h的39倍；12～48 h呈缓慢上升趋势；之后菌体数量稳定在5.0×108～7.9×108CFU之间。处理二(D-29+病原菌)D-29的数量在0～12 h内受病原菌的影响，数量呈小幅下降；12～48 h内菌体数量迅速上升，在48 h时高达1.04×109CFU；48～72 h呈下降趋势；之后趋于平稳(5.4×108～6.2×108CFU)。总体来看，两种处理下的D-29菌体数量均能在短时间内大量繁殖，之后趋于平稳。

图1　D-29菌体在梨果实伤口上数量的动态变化Fig.1　Population dynamics of D-29 in the wound of pear fruit

3结论与讨论

枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌物质来抑制病原菌的生长繁殖[15～17]。本研究表明，D-29菌悬液对采后梨褐腐病有较强的抑制效果，且随浓度的升高抑菌效果增大，这与赵妍等[18]探究枯草芽孢杆菌B10对采后草莓病害防治效果结果一致，Fan等[19]的研究也表明，随枯草芽孢杆菌B-912浓度的增大，采后桃和油桃褐腐病的发病率及病斑扩展越小，这可能与枯草芽孢杆菌能分泌抗菌物质有关，菌体浓度越大，产生抗菌物质的浓度也相应增大，对病原菌的杀伤力也增强。

D-29与病原菌接种的先后顺序及接种的时间间隔对采后梨褐腐病的发病率及对病斑扩展抑制率也有显著的影响，先接种D-29菌悬液，抑菌效果明显好于先接种病原菌孢悬液的处理组，且在先接种D-29菌悬液的处理组中，时间间隔为24 h时，可完全抑制病害的发生，抑菌效果最佳。Lu等[20]的研究表明，在接种病原菌前48～72 h接种拮抗菌，果实发病率及病害的严重程度有大幅度的下降。范青等[21]在枯草芽孢杆菌对采后柑橘青霉及绿霉病的防效试验中表明，接种拮抗菌的48 h后再接种病原菌比24 h后接种的抑菌效果要好。这些研究均表明，越早接种拮抗菌，抑菌效果越佳，这也为实际商业化条件下采后果实的储藏提供了依据，越早采取拮抗菌处理措施，越能有效控制病害的发生及发展。

D-29菌体在梨果实伤口上数量的动态变化测定结果表明，无论病原菌孢悬液的存在与否，D-29菌体均能在短时间内在果实伤口上定殖。Mercier等[22]认为，拮抗菌在果实伤口的快速繁殖是控制病害的关键因素。拮抗菌迅速繁殖，占据生存空间，摄取营养物质，不利于病原菌的生长繁殖，从而有效控制了病害的发生。

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(编辑：张贵森)

Inhibitory efficacy of postharvest brown rot in pear fruits byBacillussubtilisD-29

Wang Dan, Yao Xiaodong, Hao Xiaojuan*, Cao Hui, Li Xinfeng, Wang Jianming

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:The aim of the study was to test the inhibitory efficacy of Bacillus subtilis D-29 in control of brown rot disease of pear fruits caused by Monilinia fructigena. The inhibitory efficacy was determined by inoculating with different treatments of D-29 on the wounds of pears, and the population dynamics of D-29 in fruit wound was also determined. Results showed that D-29 could not only effectively reduce the disease rate of pear brown rot but also significantly increase the inhibition rate of disease spot enlargement; and the inhibitory ability was improving with the increasing concentration of cell suspension. The inoculation of D-29 before pathogen, disease incidence decreased obviously and inhibition rate of disease lesion expansion increased significantly. In the treatment that D-29 was inoculated in the fruit wound before pathogen, the interval time of inoculation and inhibitory efficacy had obviously positive correlation. Under the treatments both D-29+sterile water and D-29+pathogen, the population of D-29 could grow and reproduce rapidly in fruit wound.

Key words:Bacillus subtilis; Pear; Brown rot; Biological control

中图分类号：S476.9

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)03-0182-04

基金项目：山西农业大学中青年学术骨干基金(XG201210)；中国博士后基金(个人编号：92459)；山西省科技攻关项目(20140311007-3)；2014年度山西省煤基重点科技攻关项目子项目(FT201402-12)；山西省科技基础条件平台建设项目(2015091004-0104)

作者简介：王丹(1988-)，女(汉)，山西运城人，硕士研究生，研究方向：生物农药与生物防治*通讯作者：郝晓娟，副教授，硕士生导师。Tel:0354-6288344; E-mail:xiaojuanhao@126.com

收稿日期：2015-09-19修回日期：2015-11-26