尖孢镰刀菌基因组SSR位点分析

吕艺瑶，李新凤，王雪梅，王建明

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)



尖孢镰刀菌基因组SSR位点分析

吕艺瑶，李新凤，王雪梅，王建明*

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

摘要：为明确尖孢镰刀菌基因组中SSR位点的分布特点，本研究利用生物信息软件SSRIT对7条已公布的尖孢镰刀菌染色体基因组序列中的SSR位点进行了搜索，并用Excel软件对其进行统计分析。结果表明：基因组中7条染色体共有860个SSR位点，平均每条染色体出现122个SSR位点，大约每44.2 kb出现一个长度不小于18 bp的SSR位点。其中四、五核苷酸重复为主要重复类型，占全部SSR的比例分别为23.84%和32.56%；435种重复基元的分布情况存在差异，基元为ACAA/TTGT出现次数最多，为33次，其次为CAAA/TTTG，出现32次。说明尖孢镰刀菌基因组中含有丰富的SSR位点，为Genomic-SSR标记在尖孢镰刀菌鉴别中的应用奠定了理论基础。

关键词：尖孢镰刀菌；基因组；SSR

尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)作为一种世界性的土传病原真菌，具有寄主广泛、生理小种和专化型多等特点，可引起多种植物发生枯萎病害[1～4]。在农业生产中，由于其易变异和毒力变化快的特点，给植物枯萎病害的有效防治带来困难，因此明确尖孢镰刀菌的生理小种和专化型[5,6]，对农业生产中植物枯萎病害防治有着重要指导意义。目前，有关尖孢镰刀菌的鉴别方法主要有形态学鉴定[7]、分子标记(如： RFLP[8]、RAPD[9,10]、AFLP[11,12]和SCAR[13])、生物标记[14]和基因宏阵列[15]等。虽然采用这些方法实现了对尖孢镰刀菌的鉴别，但在鉴别过程中还存在一些问题，如：形态鉴定和生物标记存在耗时和操作繁琐等问题；RFLP、AFLP和SCAR存在耗时、操作繁琐、成本较高；RAPD在种间乃至近缘属之间关系的研究中存在应用局限[16]，因此高效鉴别方法的开发显得尤为重要。

SSR(Simple Sequences repeat)标记，又称为微卫星标记，在真核生物的基因组中均匀分布，不同物种基因组中，类型和重复次数存在不同，可利用其两端的保守区域设计引物，通过PCR扩增，利用微卫星长度不同产生多态性扩增产物即可实现物种鉴别[17]。与其他分子标记相比，具有多态性高、共显性、操作简单和基因组中分布广泛等优点[18]。近年来，随着NCBI、GDB和GenBank等数据库的建立为其应用提供了研究基础，目前已广泛应用到物种基因定位[19]、遗传作图[20]、品种鉴定[21]和分子标记辅助育种[22]等方面的研究中。另外，虽然目前已有苑琳[23]、李蕊倩[24]采用ISSR标记和李新凤[25]采用EST-SSR标记对尖孢镰刀菌进行研究分析，但有关利用Genomic-SSR标记来鉴别尖孢镰刀菌的研究还未见相关报道，因此本研究在尖孢镰刀菌基因组序列的基础上，利用生物信息学方法对已公布的长度在4.35 Mb以上的7条染色体基因组序列中的SSR信息进行统计分析，以了解SSR的发生频率和分布特点，旨在明确尖孢镰刀菌基因组中SSR位点的分布特性，为开发Genomic-SSR标记在尖孢镰刀菌鉴别的应用以及进一步研究中提供理论基础和科学依据。

1材料和方法

1.1材料

尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)7条染色体基因组序列以FASTA格式下载自NCBI(National Center for Biotechnology Information, 美国国家生物技术信息中心)数据库。

1.2尖孢镰刀菌基因组SSR的检索与信息分析

利用在线软件SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrt001)对尖孢镰刀菌7条染色体基因组序列中的SSR位点进行搜索。搜索条件：二核苷酸重复次数≥9，三核苷酸重复次数≥6，四核苷酸重复次数≥5，五核苷酸重复次数≥4，六核苷酸重复次数≥4，并用Excel对其进行统计分析。

2结果与分析

2.1尖孢镰刀菌7条染色体基因组序列中SSR位点搜索结果

尖孢镰刀菌7条染色体基因组序列总长度为37.12 Mb，通过在线软件SSRIT共搜到860个SSR位点(表1)，平均每条染色体基因组中包含122个SSR位点，平均每44.2 kb出现1个长度不低于18 bp的SSR位点。

2.2SSR位点分布特点及出现频率

2.2.1尖孢镰刀菌基因组中SSR位点分布特点

7条染色体基因组中符合搜索条件的2～6核苷酸重复均有分布(表1)，且各染色体基因组中SSR位点分布存在差异。7条染色体基因组中五核苷酸重复均为主要重复类型，说明五核苷酸重复为尖孢镰刀菌基因组中最主要的重复类型。1号染色体中包含的SSR位点最多(194个)，三、四核苷酸重复仅次于五核苷酸重复(65个)，均为44个明显高于其它染色体；5号染色体中SSR位点总数为130仅次于1号染色体，其余依次为2号染色体(125个)、7号染色体(124个)、3号染色体(102个)、4号染色体(94个)、6号染色体(91个)。三、四、五核苷酸为SSR位点的主要重复类型，在各染色体基因组中所占比例均在17%以上；二核苷酸重复整体分布相对较少，均低于11%；六核苷酸重复分布除3号和6号染色体低于5%，其余均高于11%。1号染色体中各种重复类型SSR位点数除六核苷酸重复与2号染色体相等且稍低于5号染色体外，其余重复类型均高于其它染色体，说明1号染色体具有很好的SSR标记开发潜力。

表1　尖孢镰刀菌不同染色体的SSR位点分布特点

2.2.2尖孢镰刀菌基因组中SSR位点分布密度

由表2可知，7条染色体基因组中五核苷酸重复不仅基元种类数和SSR位点数均为最多，分别为188和280，而且分布密度最大平均1Mb出现7.54个五核苷酸重复；二核苷酸重复最少，基元种类、SSR位点数及分布密度仅为10、69和1.86。其余重复类型基元种类数为六核苷酸重复(113个)>四核苷酸重复(71个)>三核苷酸重复(53个)；SSR位点分布密度为四核苷酸重复(5.52)>三核苷酸重复(5.06)>六核苷酸重复(3.18)。虽然三、四核苷酸的基元种类少于六核苷酸重复但是其SSR位点所占的比例以及分布密度明显高于六核苷酸重复，说明三、四、五核苷酸重复为尖孢镰刀菌染色体基因组中主要的重复类型。

表2尖孢镰刀菌基因组SSR位点分布密度

Table 2The distribution density of SSR in the genome ofFusariumoxysporum

重复类型Repeattypes基元种类数NumberofmotiftypesSSR数SSRNumber占全部SSR比例/%ProportioninallSSR密度/SSR·Mb-1Density二核苷酸10698.01.86三核苷酸5318821.95.06四核苷酸7120523.85.52五核苷酸18828032.67.54六核苷酸11311813.73.18总计435860100.023.16

表3　尖孢镰刀菌基因组中主要重复基元及出现频率

注：该表只列出出现次数排在前三的重复基元。

Note: The occurrence number of repeat motif that the former three was listed .

分析7条染色体基因组中主要重复基元及出现频率(表3)可知，二核苷酸重复中AT/TA为最主要的重复基元，出现29次，出现频率为42.03%；重复基元CA/TG和AG/CT出现次数排列于第2位，但出现频率仅为15.94%，明显低于重复基元AT/TA。三核苷酸重复中最主要的重复基元为GAA/TTC，出现次数17次，出现频率为9.04%；基元GAA/TTC和AGA/TCT次之，出现频率均为7.98%。基元CAAA/TTTG、ACAT/ATGT和ACATA/TATGT为四核苷酸重复的主要基元，其中基元CAAA/TTTG出现33次，出现频率为16.1%，明显高于其它基元；基元ACAT/ATGT和ACATA/TATGT分别出现32次和22次，出现频率为15.61%和10.73%，在四核苷酸重复中分列第二和第三位。五核苷酸重复的188种基元中，出现次数最高的是基元ACATA/TATGT，出现26次，频率为9.29%；基元ATTTG/CAAAT，出现13次，频率为4.64%；基元ACAAT/ATTGT出现7次，频率为2.5%；六核苷酸重复虽然其基元种类有113种，但是出现频率较低，出现次数最多的只有2次，频率仅为1.69%。从基元类型和出现频率进一步说明Genomic-SSR标记在尖孢镰刀菌中具有很好的应用潜力。

2.2.3尖孢镰刀菌基因组中SSR位点重复次数及长度分布情况

由SSR位点的重复次数分布情况(表4)所示，可发现尖孢镰刀菌染色体基因组中SSR位点的重复次数主要集中在4～11次，SSR数量占到总数的95.23%；重复次数在11次以上的SSR位点只有41个，仅占总数的4.77%，其中重复次数最高的为31次，该SSR位点属于三核苷酸重复。二核苷酸重复的重复次数主要集中在9、10和11，最高重复次数为25；三核苷酸重复主要集中在6～10，其中重复次数为6的SSR位点最多；四核苷酸重复主要集中在5～9，最高为11；五核苷酸重复主要集中在4～7，最高为28次；六核苷酸重复4和5，最高为8次。由此可见，各重复类型中SSR位点的重复次数各不相同，在重复次数为各检索条件最低次数时，包含的SSR位点最多，说明尖孢镰刀菌基因组中SSR位点具有很好的多态性。

表4　尖孢镰刀菌SSR位点重复次数情况表

对SSR位点的长度进行分析，结果如表5所示，SSR位点的长度分布比较广泛，共有30种不同的长度，最长为140 bp，包含SSR位点1个；最短为18 bp 包含SSR位点109个；包含SSR位点最多的长度为20 bp，包含281个SSR位点，占到总数的32.67%。重复次数的不同决定了SSR位点长度的不同，从长度进一步反映出了尖孢镰刀菌基因组中SSR位点的多态性。

表5　尖孢镰刀菌基因组中SSR长度分布表

3结论与讨论

SSR标记因其信息含量高，可高效、准确检测生物体中的遗传变异，在农作物和植物病原菌的研究中具有很大的应用潜力。本研究通过对尖孢镰刀菌1～7号染色体基因组中的SSR信息进行分析后发现尖孢镰刀菌基因组中含有丰富的SSR位点，使用SSR标记对其生理小种和专化型进行鉴定具有很好的应用潜力。这一结论同王利红[26]、李成云[27]和王士臻[28]的研究结果相同，进一步说明SSR标记在尖孢镰刀菌的鉴别中具有很好的应用潜力。

在搜索标准下尖孢镰刀菌的7条染色体基因组中共搜索到860个SSR位点，平均每条染色体可检索到122个SSR位点，平均每44.2 kb出现一个长度至少为18 bp的SSR位点。其中四核苷酸重复和五核苷酸重复为主要重复类型，这一结果与王利红[26](立枯丝核菌AG3全基因组中主要重复类型为五核苷酸重复)和李成云[27](禾谷镰刀菌基因组中五核苷酸重复为主要重复类型)的结果相同，但是在主要重复基元、重复次数和SSR数量上存在差异；与李成云[27](稻瘟病菌基因组中单核苷酸重复为主要重复类型)和王士臻[28](三核苷酸重复为主要重复类型)存在差异。造成这些异同的主要原因可能是：相同属的不同种真菌中包含的SSR位点分布特点存在着一定的相似性；不同属真菌基因组之间存在着较大差异，也可能是搜索标准不同造成的差异。

本研究基于已公布的尖孢镰刀菌1～7号染色体基因组，虽对其中包含的SSR信息进行了统计分析，发现其含有丰富的SSR信息，但在尖孢镰刀菌Genomic-SSR引物开发、多态性检测以及在尖孢镰刀菌生理小种和专化型鉴别中的实际应用潜力等方面还需进一步的研究，旨在为尖孢镰刀菌新鉴别方法的开发提供理论基础。

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(编辑：邢国芳)

Analysis of microsatellite markers in the genome ofFusariumoxysporum

Lv Yiyao, Li Xinfeng, Wan Xuemei, Wang Jianming*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801China)

Abstract:The purpose of this study was to investigate the distribution characteristics of SSR loci in genome of Fusarium oxysporum. SSR information of 7 chromosomes genome was analyzed by bioinformatics methods. A total of 860 SSRs was detected by using SSRIT and Excel, every chromosome include 122 SSRs, the average distance between SSRs was 44.2kb and 18bp was the shortest length. In addition, 435 types of motifs were found and the dominant motif types and proportion were different in their repeats. The dominant motif types were tetranucleotide repeat and pentanucleotide repeat and the proportion were 23.84% and 32.56%, respectively. The main repeat motifs were ACAA/TTGT and CAAA/TTTG，with the occurrence number 33 and 32, respectively. So, there were rich SSR loci in genome of Fusarium oxysporum and the result could provide SSR markers for the identification of Fusarium oxysporum.

Key words:Fusarium oxysporum； Genome； SSR

中图分类号：S432.44； Q933

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)03-0176-06

基金项目：山西农业大学引进人才博士科研启动项目(2013YJ09)；山西省科技基础条件平台建设项目(2015091004-0104)

作者简介：吕艺瑶(1992-)，女(汉)，山西平陆人，硕士，研究方向：病害生理及分子病理学*通讯作者：王建明，教授，博士生导师。Tel：0354-6289739；E-mail：jm.w@sohu.corn

收稿日期：2015-10-29修回日期：2015-11-27