n-Ag/AD/PLGA功能性材料的制备及生物学性能

2016-04-08崔巍巍高田林章培标

高等学校化学学报 2016年1期

关键词：山莨菪碱纳米银聚乳酸

崔巍巍, 高田林, 卢　应, 章培标, 刘　娅, 李　波

(1. 吉林大学公共卫生学院, 2. 吉林大学第一医院, 长春 130021;

3. 中国科学院长春应用化学研究所, 长春 130022)

n-Ag/AD/PLGA功能性材料的制备及生物学性能

崔巍巍1, 高田林1, 卢应2, 章培标3, 刘娅1, 李波1

(1. 吉林大学公共卫生学院, 2. 吉林大学第一医院, 长春 130021;

3. 中国科学院长春应用化学研究所, 长春 130022)

摘要利用静电纺丝技术制备了纳米银(n-Ag)/山莨菪碱(AD)/聚乳酸-乙醇酸(PLGA)功能性材料. 通过场发射扫描电子显微镜(ESEM)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究了材料的微观结构及组成, 评价了材料的体外药物释放、抑菌性、细胞相容性及细胞毒性. FTIR结果表明, 山莨菪碱已担载到n-Ag/AD/PLGA材料中, 且随着山莨菪碱含量的增加, n-Ag/AD/PLGA材料内纤维的平均直径逐渐增大. 药物释放试验结果证明, 山莨菪碱可以逐渐释放. 当山莨菪碱的质量分数为1%～5%时, n-Ag/AD/PLGA材料无毒性, 且有助于小鼠L929成纤维细胞的生长和增殖. 研究结果表明, n-Ag/AD/PLGA材料具有良好的抗菌性能和细胞相容性, 担载的山莨菪碱可有效释放, 为糖尿病足部感染的临床治疗提供新的人工敷料.

关键词静电纺丝; 敷料; 纳米银; 聚乳酸-乙醇酸; 山莨菪碱

糖尿病足部感染(DFIs)是一种发生在糖尿病患者踝关节以下部位, 以局部炎症或化脓为主要特征(有时伴有全身性脓毒症表现)的临床综合征[1]. 山莨菪碱(AD)作为一种抗胆碱药, 在临床上用于糖尿病足部溃疡的治疗[2,3]. 研究发现, 将敷料浸泡在含有山莨菪碱药物的溶液中用于患者足部湿敷, 可改善患处组织血液供应, 促进局部微循环, 有助于缓解静脉淤血, 消除组织缺氧, 抑制粒细胞和血小板的聚集[4～6]. 但单纯的静脉滴注或局部涂抹均存在频繁给药、血药浓度不易控制及易产生副作用等弊端, 可控的药物缓释技术有望解决这一问题.

聚乳酸-乙醇酸(PLGA)是无毒、无害且可降解的生物材料, 广泛应用于医用支架材料的制备领域[7,8]. Zheng等[9～11]研究发现, 采用静电纺丝技术将PLGA与药物共混制备具有超细纤维的可降解人工敷料, 不但有利于细胞的黏附和增殖, 而且担载的药物可缓慢释放, 有助于提高药物的生物利用率, 减少血药浓度波动和毒副作用. 近年来, 将纳米银(n-Ag)作为抗菌成分用于功能性敷料的研制受到广泛关注, 与其它抗菌药物相比,n-Ag具有高活性、广谱抗菌、抗缺氧及生理调节效能的优点[11～13].

本文将n-Ag, AD与PLGA共混, 采用静电纺丝法制备n-Ag/AD/PLGA复合材料, 研究了其抗菌性及生物相容性, 结果表明,n-Ag/AD/PLGA材料不仅具有良好的生物相容性和可降解性, 同时可缓慢释放n-Ag和AD, 可实现广谱抗菌、改善DFIs患者局部微循环障碍及促进溃疡面修复和皮肤微血管再生.

1实验部分

1.1试剂与仪器

PLGA[n(LA)∶n(GA)=80∶20], 黏均分子量85000, 由中国科学院长春应用化学研究所合成; Poviargol纳米银(n-Ag), 粒径60 nm, 俄罗斯科学院惠赠; 改良的伊格尔培养基(DMEM), Gibco公司; 细菌培养基(LB), Lennox公司; 标准胎牛血清(FBS), 北京元亨金马生物技术开发有限公司; 胰蛋白酶, Gibco公司; 噻唑兰(MTT), Solarbio公司; 琼脂粉, 长春宝泰克生物科技公司; 氯仿, 纯度99%, 北京化工厂; 山莨菪碱(AD)注射液, 浓度10 mg/mL, 天津药业集团新郑股份有限公司; 金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和大肠杆菌(8099), 长春宝泰克生物科技公司.

高压静电发生器, 苏州市吴县东诸金属涂装设备厂; XL30 ESEM-FEG型场发射环境扫描电子显微镜(ESEM), 美国FEI公司; Infinite M200型多功能酶标仪, 美国TECAN公司; CO2培养箱, Sanyo公司; 2000型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR), 美国PerkinElmer公司.

1.2n-Ag/AD/PLGA材料的制备

将n-Ag均匀分散在氯仿中, 制成n-Ag质量分数为4%的溶液A; 将PLGA溶解于溶液A中, 使PLGA质量分数为7%, 得到溶液B; 将不同质量的山莨菪碱分散在溶液B中, 得到n-Ag/AD/PLGA静电纺丝混合溶液C, 山莨菪碱在溶液C中的质量分数分别为1%, 5%和10%, 室温下搅拌过夜. 静电纺丝喷丝口直径0.4 mm, 喷丝口和收集屏之间距离23 cm, 两者之间施加30 kV静电场电压, 电纺丝温度20 ℃, 8 h后在收集屏上得到n-Ag/AD/PLGA材料, 真空干燥48 h.

1.3n-Ag/AD/PLGA材料的药物释放

用全波长酶标仪, 通过全波长扫描的方法检测山莨菪碱的最大吸收波长, 绘制山莨菪碱溶液的标准曲线; 取100 mgn-Ag/AD/PLGA, 浸没于10 mL的磷酸缓冲液(PBS)中, 于37 ℃以60 r/min的速度振荡固定孵育, 分别于不同的观察时间点取出1 mL的待测释放液, 测量其吸光度值[14].

1.4n-Ag/AD/PLGA材料的抗菌性实验

采用改良的K-B技术[15]评价n-Ag/AD/PLGA材料的抗菌性. 实验前在LB培养基中进行菌种活化, 于37 ℃以90 r/min的速度振荡12 h, 在营养琼脂培养基平皿表面滴加150 μL已活化的细菌菌液, 均匀涂抹, 晾干后, 将直径为1 cm的圆形材料固定于琼脂表面, 于37 ℃恒温培养24 h后观察抑菌情况.

1.5山莨菪碱的细胞增殖实验

复苏培养小鼠L929成纤维细胞系, 将L929细胞接种于96孔板, 细胞浓度为1×104Cell/孔, 于37 ℃和5% CO2条件下培养12 h; 除去培养液, 加入含有山莨菪碱的培养基继续培养, 浓度分别为0.125, 0.25, 0.5, 1和2 mg/mL, 于24和96 h利用MTT法测定山莨菪碱对细胞增殖能力的影响, 细胞相对增殖率(RGR)按下式[16]计算:RGR(%)=(AExp/AControl)×100%式中:AExp为实验组的吸光度值;AControl为空白对照组的吸光度值.

1.6n-Ag/AD/PLGA材料的细胞增殖及浸提液的细胞毒性实验

将L929细胞以1×105Cell/孔的浓度接种于静电纺丝的n-Ag/AD/PLGA材料表面, 在37 ℃, 5% CO2条件下培养, 用MTT法分别在24和96 h测定细胞在材料表面的生长及增殖情况. 根据GB/T16886.5[17]对材料浸提液进行细胞毒性评价.

1.7统计学分析

用ImageJ软件计算纤维的平均直径, 用SPSS16.0软件进行数据统计分析, 所有数据均以(均数±标准差)表示, 组间比较采用单因素方差分析, 当P<0.05时, 认为差异具有统计学意义.

2结果与讨论

2.1n-Ag浓度的选择

Fig.1　Antibacterial test results against E. coli(A) and S.aureus(B) on n-Ag/PLGA fibers with different contents of n-Ag after 24 h incubation Mass fration of n-Ag(%): a. 0; b. 2; c. 4; d. 8.

Cui等[11]发现, 当n-Ag粉体在PLGA纤维膜中质量分数达到1%以上时, 对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌具有抗菌活性, 随着浓度升高, 抗菌性能增强; 但当n-Ag含量达到5%和10%时, PLGA纤维膜具有轻微的细胞毒性. 本文选取n-Ag粉体质量分数为0, 2%, 4%和8%的n-Ag/PLGA静电纺丝材料进行静态抑菌环实验. 结果表明(图1), 单纯PLGA静电纺丝材料对细菌无抗菌效果, 质量分数为2%的n-Ag/PLGA静电纺丝材料抑菌效果不明显, 而当n-Ag质量分数达到4%时, 静电纺丝材料具有明显的抑菌效果. 由于n-Ag质量分数达到5%时,静电纺丝材料具有轻微细胞毒性.因此, 本文制备n-Ag/AD/PLGA静电纺丝材料时, 选择n-Ag在纺丝溶液中的质量分数为4%, 既具备良好的抗菌性, 又无细胞毒性.

2.2n-Ag/AD/PLGA材料的微观结构

由ESEM结果(图2)可见,n-Ag/AD/PLGA静电纺丝材料内部纤维互相交错,形成遍布微孔的孔状结构. 不同山莨菪碱含量的材料平均直径不同,n-Ag/PLGA材料的平均直径为(1.21±0.47) μm. 而随着山莨菪碱浓度的增加(1%, 5%和10%),纤维的平均直径呈现先减小后增大的趋势[(0.78±0.43), (0.82±0.35)和(1.31±0.49) μm]. 可见当山莨菪碱的质量分数达到10%时纤维的直径最大.

Fig.2　ESEM images of n-Ag/AD/PLGA electrospun fibers(* P<0.05) 　Mass fraction of AD in n-Ag/AD/PLGA(%): (A) 0; (B) 1; (C) 5; (D) 10.　 (E) Average diameters of (A—D).

Fig.3　FTIR spectra of PLGA(a), n-Ag/PLGA(b) 　and n-Ag/AD/PLGA fibers(c)

静电纺丝纤维直径的改变和表面形貌的变化与电纺丝溶液的浓度、药物的质量分数和电压等因素有关[12]. 山莨菪碱的加入影响了PLGA在共混液中的浓度, 从而使纤维直径变细, 而随着山莨菪碱含量的逐渐增加, 溶液电导率增加, 使射流稳定长度变短; 同时, 由于药物不溶于有机溶剂, 随着药物含量的增加, 加速了喷口阻塞速度, 影响喷口对纤维的拉神, 从而使纤维的直径逐渐增大.

2.3n-Ag/AD/PLGA的体外释放性能

Fig.4　Cumulative release curve of n-Ag/AD/PLGA　fibers with different contents of AD　Mass fraction of AD(%): a.1; b. 5; c. 10.

图4给出n-Ag/AD/PLGA中山莨菪碱体外累计释放曲线图. 由图4可以看出, 在释放初期, 1%和5%的药物释放速度稳定, 2 d后释放速度明显加快, 96 h时山莨菪碱几乎全部释放; 而山莨菪碱质量分数为10%时, 在释放初期释放速度较快, 但没有明显的突释现象, 随着时间的延长, 药物释放逐渐平缓, 到192 h时, 山莨菪碱的释放量达到约92.98%.

2.4n-Ag/AD/PLGA的抗菌性

静态抑菌环实验结果见图5. 单纯PLGA静电纺丝纤维膜无抑菌效果, 而n-Ag/AD/PLGA均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌性, 说明山莨菪碱的加入并不影响n-Ag的抑菌活性.

Fig.5　Antibacterial test results against E. coli (A) and S. aureus(B) on fibers with different contents of 　AD after 24 h incubation and average diameters of inhibition ring(* P<0.05)(C)　a. PLGA; mass fraction of AD(%) in n-Ag/AD/PLGA: b. 0, c. 1, d. 5, e. 10.

Fig.6　MTT test of the cytotoxicity of different 　electrospun fibers(* P<0.05)　a. PLGA. Mass fraction of AD in n-Ag/AD/　PLGA(%): b. 0; c. 1; d. 5; e. 10.

2.5n-Ag/AD/PLGA的细胞毒性及细胞增殖情况

n-Ag/AD/PLGA浸提液的细胞毒性如图6所示, 当n-Ag 质量分数为4%时,n-Ag/PLGA的RGR值大于75%, 无细胞毒性; 随着n-Ag/AD/PLGA中山莨菪碱浓度的升高, L929细胞相对增殖率逐渐降低; AD质量分数为1%和5% 的n-Ag/AD/PLGA的RGR值大于75%, 无细胞毒性; 而当山莨菪碱质量分数达到10%时,n-Ag/AD/PLGA的RGR值小于75%, 且大于50%, 具有轻微的细胞毒性. 山莨菪碱的细胞增殖实验结果表明, 高浓度的山莨菪碱对L929细胞增殖有一定的抑制作用, 同时通过释放实验推算, 24 h所释放的山莨菪碱药物量已达到抑制L929细胞增殖的浓度, 因此表现出轻微的细胞毒性.

Fig.7　Cell viability of L929 cells cultured on different 　electrospun fibers(* P<0.05)　a. PLGA. Mass fraction of AD in n-Ag/AD/PLGA(%): 　b. 0; c. 1; d. 5; e. 10.

在一定浓度下, 山莨菪碱对L929的增殖有一定的促进作用. 随着培养时间的增加, 吸光度值升高, 细胞数量逐渐增多, 山莨菪碱对L929的促进作用更加明显. 当山莨菪碱浓度升高到1 mg/mL时, 抑制L929的增殖, 随着山莨菪碱浓度继续增高, 抑制作用更加明显, 说明山莨菪碱浓度过高时, 对L929的增殖有一定毒性.

细胞增殖实验结果(图7)表明, 随着培养时间的延长, 材料表面吸光度值升高(P<0.05), 细胞逐渐增多. 在相同培养时间下,n-Ag/PLGA吸光度值略低于对照组, 说明n-Ag没有促进L929增殖的作用. 加入山莨菪碱之后, 当山莨菪碱的含量在1%～5%时, 吸光度值略有提高, 但与n-Ag/PLGA相比, 没有统计学差异, 说明在一定浓度范围内, 山莨菪碱的加入没有抑制L929细胞增殖的作用, 且相对n-Ag/PLGA有促进L929细胞增殖的趋势. 当山莨菪碱的含量增加到10%时, L929细胞成生长抑制, 说明高浓度的山莨菪碱不利于L929细胞的增殖, 这也与单纯山莨菪碱细胞增殖实验的结果相类似.

3结论

本文制备的n-Ag/AD/PLGA材料具有一定可控的药物缓释能力,n-Ag发挥了良好的抑菌性; 当山莨菪碱含量在1%～5%时, 无细胞毒性, 作为功能性医用敷料在糖尿病足治疗中具有广阔的临床应用前景.

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Preparation and Biological Evaluation of Electrospun

Nano-silver/Anisodamine/PLGA†

CUI Weiwei1, GAO Tianlin1, LU Ying2, ZHANG Peibiao3, LIU Ya1, LI Bo1*

(1.SchoolofPublicHealth, 2.FirstBethuneHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China;

3.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China)

Abstract Nano-silver powders(n-Ag)/Anisodamine(AD)/poly(lactide-co-glycolide)(PLGA) were prepared by electrospinning. Field emission scanning electron microscope(ESEM) and Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR) were applied for the investigation of the microscopic structure of the dressings as well as drug release, antibacterial and biological functions so that we could comprehensively evaluate the functionality of the dressings. The results show that the fibers exhibit a fully interconnected pore structure with narrow pore size distribution. And the diameters of electrospun fibers are influenced by the incorporation of AD. The result of drug release test proves that anisodamine can gradually release. It is also found that then-Ag/AD/PLGA dressings exhibit a well antibacterial ability. The cell experimental results show that when the content of AD is from 1% to 5%, the dressings are non-toxic and contribute to the growth and proliferation of mouse L929 cells. Therefore, we conclude that then-Ag/AD/PLGA dressing possesses good biocompatibility, antibacterial properties, and effectively release. It provides a new strategy for clinical treatment in diabetic foot infection.

KeywordsElectrospinning; Dressing; Nano-silver; Poly(lactide-co-glycolide); Anisodamine

(Ed.: W, Z)

† Supported by the Major Project of Science and Technology of Jilin Province, China(No.20130201005GX).

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