鹿药化学成分及其抗肿瘤活性

赵淑杰， 洪 波， 韩忠明， 杨利民

（吉林农业大学，吉林长春130118）



鹿药化学成分及其抗肿瘤活性

赵淑杰， 洪 波， 韩忠明， 杨利民

（吉林农业大学，吉林长春130118）

摘要:目的 研究鹿药Smilacina jaPonica A.Gray根茎及根的的化学成分及其抗肿瘤活性。方法 鹿药乙醇提取物采用大孔吸附树脂、硅胶、凝胶色谱柱和重结晶等方法分离纯化，根据波谱数据及理化性质鉴定所得化合物的结构。然后，MTT法考察其对人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人胃癌细胞株BGC-823和人肺腺癌细胞株SPC-A1的抑制作用。结果 从中分得3个化合物，分别鉴定为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）、薯蓣皂苷（2）、（25R）-海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-［β-D-吡喃木糖基（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷（3）。其中，化合物1对SPC-A1细胞、化合物3对Caco-2和MCF-7细胞增殖有较强的抑制作用，化合物2对Caco-2细胞有抑制作用。结论 首次从鹿药中分离得到3个甾体皂苷均具有一定的抗肿瘤活性。

关键词:鹿药；化学成分；抗肿瘤

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.022

KEY W 0RDS: Smilacina jaPonica A.Gray；chemica1constituents；anti-tumor

鹿药Smilacina jaPonica A.Gray为百合科鹿药属多年生草本植物，药食同源，地下根茎及根为民间常用中药［1］。据考证，鹿药始自《千金·食治》，性“甘、苦、温，无毒”，具有补气益肾、祛风除湿、活血调经功效［2-3］。在我国，这一野生资源分布十分广泛，储量巨大，因其药食两用价值，越来越被人们所关注［4-5］，故深入研究其药效的物质基础是非常必要的，也将为开发新药源提供依据。报道显示，从鹿药属植物中分离得到的成分多为甾体皂苷，具有抗真菌和抗肿瘤活性［6-7］，本课题组前期对鹿药根茎及根的化学成分进行研究，已分离得到5个黄酮类化合物［8］，现又得到3个皂苷化合物，分别鉴定为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）、薯蓣皂苷（2）、（25R）-海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-［β-D-吡喃木糖基（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷（3），均为首次从鹿药中分离得到。其中，化合物1和3也为首次从鹿药属植物中分离得到，而且3个化合物均具有一定的抑制肿瘤细胞增殖作用。

1 材料与仪器

1.1 材料 鹿药样品采自吉林省九台市马虎头山，经吉林农业大学杨利民教授鉴定为百合科鹿药属植物鹿药S.jaPonica的根茎及根，洗净阴干，备用。

1.2 细胞株 人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院药物所提供；人胃癌细胞株BGC-823、人肺腺癌细胞株SPC-A1由吉林农业大学生命科学学院提供，均按实验室常规方法保存和培养。

1.3 仪器与试剂 DL-1000E智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；X-4数字显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）；WWZ-2A自动旋光仪（上海科登精密仪器有限公司）；FTIR-8400S傅立叶变换红外光谱仪（KBr压片，日本岛津公司）；Agi1ent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；AV400核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；MATLCQ电喷雾质谱仪（美国Finigan公司）。96孔细胞培养板（美国Corning Costar公司）；CO2培养箱（美国Forma Scientific公司）；超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TS-2脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DG5032酶联免疫检测仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司）。新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；胰蛋白酶、噻唑蓝（美国Amresco公司）；二甲基亚砜（天津市北联精细化学品开发有限公司）。甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；D101大孔吸附树脂；柱色谱及薄层色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司）。

2 方法

2.1 提取与分离 取粉碎后的鹿药根茎及根2.8 kg，加5倍量90％乙醇浸泡12 h后，50℃下超声（300 W、70 kHz）提取40 min，过滤，滤渣分别加入5倍量80％、70％乙醇提取2次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得棕色浸膏。将浸膏（1 087 g）水溶后，分2次过D101大孔吸附树脂柱（10 cm×80 cm，1.8 kg），先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再依次用30％、50％、70％、90％乙醇洗脱，分别洗脱至流出液无色，将各洗脱部分减压浓缩蒸干，分别得到56.87、15.93、16.32、2.23 g提取物。取70％乙醇洗脱部分12 g，干法上硅胶柱（200～300目），氯仿-甲醇梯度洗脱（9∶1→2∶8），经薄层色谱检测，合并相同流份，得到Fr.A～Fr.G，各部分反复经硅胶、SePhadex LH-20凝胶和重结晶等方法纯化。Fr.C（4.76 g）得化合物1（143 mg）；Fr.D（1.83 g）得化合物2 （34 mg）；Fr.E（2.30 g）得化合物3（73 mg）。

2.2 MTT法检测细胞增殖 采用MTT法，测试3个鹿药单体皂苷对肿瘤细胞增殖的影响。选对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×104/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h，吸去培养液，加入含有药物的培养液200 μL，设6个药物终质量浓度组（1.25、2.5、5.0、10、20、40 μg/mL）及阴性对照组（含DMSO溶媒的培养液），另设调零组（只加培养液），每组设6个复孔，加药后置于37℃、5％CO2培养箱中培养48 h。将含药培养液吸去，加入体积比为4∶1的无血清培养液和MTT（终质量浓度为5 mg/mL）共100 μL，继续孵育4 h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解（5 min），酶标仪在570 nm主波长、630 nm副波长下检测各孔的吸光度（A）值。然后，计算各浓度化合物对细胞生长的抑制率，公式为细胞生长抑制率=（1 -A加药孔/ A阴性对照）×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC50值。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1:白色颗粒，易溶于甲醇，［α］20D= -31.8°（c=0.17，MeOH），mP 201～204℃，Libermann-Burchard反应阳性，Mo1ish反应阳性，与Ehrish试剂显红色，提示该化合物为呋甾皂苷。ESI-MS m/z: 977.3［M+H］+、917.3［M-59］+（即［M-AcO］+）。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ: 5.74（1H，t，J=9.6 Hz，H-12），5.18（1H，brs，H-6），4.34 （1H，t，J=6.8 Hz，H-16），3.99（1H，m，H-3），3.39、3.38（各1H，s，H-26），2.54（2H，s，H-4），2.26（3H，s，CH3C=O），2.15、1.62（1H，m；1H，s，H-7），2.14（1H，m，J=7.2 Hz，H-20），2.09（2H，m，H-15），1.95（1H，s，H-14），1.87 （2H，s，H-11），1.74、1.93（1H，s；1H，m，H-2），1.67、1.64（各1H，s，H-1），1.58、1.78（1H，s；1H，s，H-23），1.46（2H，m，H-24），1.46 （1H，m，H-25），1.39（1H，m，H-8），1.11（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-19），0.87 （1H，s，H-9），0.84（3H，s，H-18），0.57（3H，d，J=5.6 Hz，H-27），三组糖的氢信号δ: 4.78 （1H，d，J=7.6 Hz，H-1 of G1u），4.28（1H，m，H-2 of G1u），3.64（1H，d，J=9.6 Hz，H-3 of G1u），4.47（1H，m，H-4 of G1u），3.61（1H，s，H-5 of G1u，与C-5 of G1u相关较弱），4.49（1H，d，J= 3.2 Hz，H-6 of G1u）；5.40（1H，brs，H-1 of Rha），4.11（1H，m，H-2 of Rha），4.47（1H，d，J= 3.2 Hz，H-3 of Rha），5.59（1H，m，H-4 of Rha），4.67（1H，m，H-5 of Rha），1.68（3H，d，J=6.8 Hz，H-6 of Rha）；4.90（1H，d，J=7.6 Hz，H-1 of G1u26），3.82（1H，t，J=8.0 Hz，H-2 of G1u26），3.71（1H，m，H-3 of G1u26），4.03（1H，m，H-4 of G1u26），3.96（1H，m，H-5 of G1u26，与C-5 of G1u26相关较弱），4.18（2H，dd，J=4.8，5.2 Hz，H-6 of G1u26）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δ: 37.6（C-1），30.1（C-2），77.7（C-3），38.7（C-4），140.7 （C-5），122.1（C-6），32.5（C-7），32.6（C-8），50.3（C-9），37.2（C-10），21.1（C-11），76.2（C-12），45.3（C-13），53.1（C-14），31.9（C-15），90.2（C-16），90.3（C-17），17.4（C-18），19.5（C-19），44.9（C-20），9.9（C-21），109.9（C-22），32.1（C-23），28.9（C-24），30.6（C-25），66.8（C-26），17.3（C-27），21.6（CH3C=O），170.9（C= O）。三组糖的碳信号δ: 99.7，77.6，76.9，70.2，76.8，61.1（C-1～C-6 of G1u）；99.4，74.1，70.2，74.4，70.1，18.7（C-1～C-6 of Rha）；106.2，75.3，78.1，71.2，78.7，67.6（C-1～C-6 of G1u26）。根据理化性质及波谱数据，结合HMQC、HMBC和TOCSY谱，对分子中的C、H信号进行归属，并参考文献［9-12］，确定化合物1为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构见图1。

化合物2:白色粉末，mP 186～189℃，具辛辣味，Liebermann和Mo1ish反应均呈阳性，显示该化合物为皂苷。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ: 6.35 （1H，brs，H-1 of Rha2），5.80（1H，brs，H-1 of Rha1），5.31（1H，m，H-6），4.93（1H，d，J= 7.7 Hz，H-1 of G1u），1.04（3H，s，H-21），1.03 （3H，s，H-19），0.98（3H，d，J=5.8 Hz，H-27），0.80（3H，s，H-18）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δ: 37.6（C-1），30.2（C-2），79.0（C-3），39.9（C-4），141.0（C-5），121.9（C-6），32.3（C-7），31.8（C-8），50.4（C-9），37.6（C-10），21.2（C-11），40.2（C-12），40.6（C-13），56.8（C-14），32.4（C-15），81.2（C-16），63.0 （C-17），16.4（C-18），19.5（C-19），42.1（C-20），15.1（C-21），109.3（C-22），30.9（C-23），29.4（C-24），30.7（C-25），66.9（C-26），17.4 （C-27）。三组糖信号: 100.4，78.8，72.6，78.0，76.9，61.5（C-1～C-6 of G1u）；102.1，73.2，72.9，74.2，70.5，18.5（C-1～C-6 of Rha1）；103.0，72.6，72.8，73.9，69.6，18.7（C-1～C-6 of Rha2）。以上数据与文献［13］报道基本一致，故鉴定化合物2为薯蓣皂苷。

化合物3:白色粉末，mP 262～264℃，Liebermann-Burchard和Mo1ish反应均呈阳性，显示该化合物为皂苷。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）高场区有4个甲基质子信号δ: 1.35（3H，d，J=6.9 Hz，H-21），1.08（3H，s，H-18），0.70（3H，d，J= 5.4 Hz，H-27），0.66（3H，s，H-19）；低场区有4个糖端基质子信号δ: 5.57（1H，d，J=7.3 Hz，H-1 of Xy1），5.23（1H，d，J=7.7 Hz，H-1 of G1u1），5.18（1H，d，J=7.9 Hz，H-1 of G1u2），4.85（1H，d，J=7.7 Hz，H-1 of Ga1）；26位2个氢信号δ: 3.59（1H，dd，J=10.5，2.3 Hz，H-26a），3.49（1H，dd，J=10.5，10.5 Hz，H-26b），两者无显著差异，显示为25R型螺甾皂苷［9］。13CNMR（100 MHz，C5D5N）δ: 36.7（C-1），29.7 （C-2），77.2（C-3），34.7（C-4），44.5（C-5），28.6（C-6），31.5（C-7），34.4（C-8），55.4（C-9），36.3（C-10），38.0（C-11），212.7（C-12），55.6（C-13），56.0（C-14），31.9（C-15），79.7 （C-16），54.4（C-17），16.1（C-18），11.8（C-19），42.7（C-20），13.9（C-21），109.3（C-22），31.7（C-23），29.3（C-24），30.6（C-25），67.0 （C-26），17.3（C-27）。四组糖信号δ: 102.5，73.2，75.7，79.9，75.4，60.7（C-1～C-6 of Ga1）；104.8，81.3，87.0，71.2，77.6，63.0（C-1～C-6 of G1u1）；105.1，75.1，78.7，70.8，67.4（C-1～C-5 of Xy1）；105.0，76.2，78.7，70.5，77.8，62.6（C-1～C-6 of G1u2）。以上数据与文献［12，14］基本一致，故鉴定化合物3为（25R）-海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-［β-D-吡喃木糖基（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷。

3.2 鹿药皂苷对细胞增殖的影响(表1) 化合物1对乳腺癌细胞MCF-7和肺腺癌细胞SPC-A1增殖具有抑制作用，而且随质量浓度增大，抑制率也增大，IC50分别为14.87和7.67 μg/mL，可见其对SPC-A1有较强的抑制作用；化合物2只对结肠癌细胞Caco-2有抑制作用；化合物3对Caco-2和MCF-7增殖均有较强的抑制作用。综上所述，鹿药中分离得到的几个甾体皂苷对肿瘤细胞均有一定的抑制活性。

表1　化合物对肿瘤细胞的抑制作用Tab.1 Inhlbltory effects of com pounds on tum or cells

4 结论

在目前治疗癌症、心脑血管疾病、糖尿病等高发疾病的药物方面，天然药物扮演着非常重要的角色。据统计，从1981年到2008年间已上市的抗肿瘤药物中，有62.9％来自天然产物或其衍生物，因此从天然产物（特别是药用植物）中寻找治疗和预防疾病的安全有效的生物活性成分，并开发成新药，已成为当前药学及化学领域中研究的热点。本实验结果显示，从鹿药中分离得到的甾体皂苷可能具有抗肿瘤活性，对揭示其药用价值的物质基础具有重要意义，也为抗肿瘤的天然药物筛选提供依据，值得进一步深入探究。

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Chem lcal constltuents and thelr antl-tumor actlvltles of Smilacina japonica

ZHAO Shu-jie， HONG Bo， HAN Zhong-ming， YANG Li-min
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

ABSTRACT:AIM To study the chemica1 constituents and their anti-tumor activities of rhizomes and roots of Smilacina jaPonica A.Gray.METH0 DS The iso1ation and Purification of S.jaPonica ethano1ic extractwere Performed on macroPorous resin，si1ica，SePhadex LH-20 ge1 chromatograPhy and recrysta11ization.The structures of obtained comPounds were e1ucidated based on sPectra1 data and Physicochemica1ProPerties.Then the inhibition effects of them on human co1on cancer Caco-2，human breast cancer MCF-7，human gastric cancer BGC823 and human 1ung adenocarcinoma SPC-A1 ce111ineswere investigated by MTTmethod.RESULTS Three comPounds were iso1ated and identified as26-O-β-D-g1ucoPyranosy1-（25R）-furost-5-en-3β，12，17α，22ξ，26-Pento1-12-O-acety1e-3-O-α-L-rhamnoPyranosy1-（1→2）-β-D-g1ucoPyranoside（1），dioscin（2）and（25R）-hecogenin saPonin 3-O-β-D-g1ucoPyranosy1（1→2）-［β-D-xy1oPyranosy1（1→3）］-β-D-g1ucoPyranosy1（1→4）-β-D-ga1actoPyranoside（3）.Among them，comPound 1 showed a strong inhibitory effect on the growth of human 1ung adenocarcinoma SPC-A1 ce11，comPound 3 showed strong inhibitory effects on the growth of human co1on cancer Caco-2 and human breast cancer MCF-7 ce11s，and comPound 2 showed a inhibitory effect on human co1on cancer Caco-2 ce11.C0 NCLUSI0 N Three comPounds iso1ated from this P1ant for the first time have anti-cancer effects.

作者简介:赵淑杰（1976—），女，博士，副教授，研究方向为天然产物化学。Te1:（0431）84532955，E-mai1: zhsj1ong@163.com

基金项目:吉林省自然科学基金项目（20140101128JC）

收稿日期:2015-04-01

中图分类号:R284.1

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0332-04